單學(xué)強(qiáng)，李明義，高 軒＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.山東信得科技股份有限公司，山東青島266061）

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染?。?］，給世界各國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失。從IBDV發(fā)現(xiàn)至今，新的變異株和超強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn)，使得原有傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗無(wú)法阻止IBD的發(fā)生和流行。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)更加安全、有效的新型疫苗。VP2是IBDV主要的宿主保護(hù)性抗原［2］，可以誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生病毒中和性抗體，具有型特異性，已成為近年來(lái)是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

本研究利用分離的IBDV LN株基因組核酸為模板，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET28a－VP2；使用大腸埃希菌進(jìn)行原核表達(dá)，制備VP2蛋白并分析VP2蛋白的生物學(xué)活性，為雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集發(fā)病雞的法氏囊組織（病料來(lái)自遼寧省大連市發(fā)病雞場(chǎng)），置－70℃冷凍保存；SPF雞胚和SPF雞購(gòu)自濟(jì)南昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.2 主要試劑 E.coli DH5α及E.coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存、p MD18－T 載體，購(gòu)自Ta KaRa公司，p ET28a載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；IBDV標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Taq酶及限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ，購(gòu)自TaKaRa公司；MLV，購(gòu)自Promega公司；TRIzol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司；Gel Extraction Kit（50），購(gòu)自O(shè)MEGA公司；HRP標(biāo)記羊抗雞IgG，購(gòu)自索萊寶生物公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中登錄的IBDV VP2序列（AB024076.1），利用生物學(xué)軟件DNA Star對(duì)IBDV VP2基因進(jìn)行同源性比較和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、開(kāi)放閱讀框（ORF）及模擬抗原表位分析，利用primer5，0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物進(jìn)行套式PCR。擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)1 370 bp。

第一 套引物：上游引物 5′－GAC AAA CGA TCG CAG CG －3′，下游引物 5′－GGC AGG TGG GAA CAA TG－3；第二套引物：上游引物5′－GCG AAT TCA TGA CAA ACC TGC AAG ATC－3′（下劃線處酶切位點(diǎn)為Eco RⅠ），下游引物5′－GGAAG CTTTCA CCT TAT GGC CCG GAT TAT G－3′（下劃線處酶切位點(diǎn)為Hin dⅢ）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離 取法氏囊組織1.36 g，按1∶5的比例（質(zhì)量比）加無(wú)菌PBS勻漿，反復(fù)凍融3次，6 000 r／min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌后，經(jīng)絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種9日齡SPF雞胚10枚，每胚接種病毒液0.2 mL；另設(shè)5枚雞胚接種生理鹽水作為對(duì)照，每枚接種0.2 mL。接種后24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去，每隔6 h照胚1次，收集120 h內(nèi)死亡的雞胚，觀察雞胚病變，收集病變明顯的絨毛尿囊膜進(jìn)行勻漿處理，反復(fù)凍融3次后，6 000 r／min離心10 min，取上清將分離到的病毒液，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將15羽同一批次的4周齡SPF雞隨機(jī)分成兩組，人工攻毒組10羽，每羽0.1 mL病毒液擦肛，正常對(duì)照組5羽，每羽0.1 mL生理鹽水擦肛。在隔離器內(nèi)相同條件下飼養(yǎng)，每日觀察兩組雞的臨床癥狀，96 h后處死全部雞只，觀察并比較病理變化。取病變典型雞只的法氏囊組織按1∶3比例加入PBS勻漿后反復(fù)凍融3次，離心取上清進(jìn)行瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 IBDV VP2基因片段的擴(kuò)增、克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取雞胚尿囊膜中IBDV的總RNA，應(yīng)用RT－PCR擴(kuò)增IBDV VP2基因片段；PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)8 g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，連接到p MD18－T載體上，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為p MD－VP2，經(jīng)過(guò)PCR及Eco RⅠ、Hin dⅢ雙酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后使用Eco RⅠ、Hin dⅢ分別雙酶切p MD－VP2和pET28a，酶切產(chǎn)物用8 g／L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將目的條帶分別用凝膠回收試劑盒回收后，在T4 DNA ligase的作用下16℃連接過(guò)夜。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a－VP2轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá) 在溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)物濃度3個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)3個(gè)因素交互作用，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化。表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)用SDS－PAGE和 Western blot進(jìn)行分析［3］。

1.2.5 VP2蛋白的制備及免疫原性分析 取2 g誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體加入20 mL含10 mL／L Triton X－100的p H8.0 PBS洗滌1次，在4℃以10 000 r／min離心2 min，棄上清。加入20 mL p H8.0的PBS，加 溶 菌 酶 至 100μg／mL，加 EDTA 至 2 mmol／L，37℃保溫1 h。反復(fù)凍融3次，重懸置于冰上用超聲波細(xì)胞破碎儀于功率200 W下破碎（工作4 s，間隔4 s，60次循環(huán)）后，在4℃以12 000 r／min離心20 min，收集上清加入2 mL／L的甲醛37℃恒溫振蕩24 h。將制備的含有VP2蛋白的上清液與白油佐劑按1∶2的比例乳化制成油乳劑疫苗。將3周齡15羽SPF雞隨機(jī)分成兩組，第一組10羽每只雞注射油乳劑疫苗0.3 mL，第二組5羽每只雞注射0.2 mL白油佐劑作為對(duì)照組，免疫注射后3周翅下采血，分離血清，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雞胚接種試驗(yàn)

雞胚在接種后72 h～120 h內(nèi)全部死亡，死亡雞胚尿囊膜增厚、水腫、出血。死亡胚體周身水腫，出血，以頭和趾部出血較為嚴(yán)重，肝臟有斑駁狀壞死，心臟灰白色呈熟肉樣，對(duì)照組雞胚健活。

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

SPF雞接種后36 h出現(xiàn)精神呆滯，食欲廢絕，背部羽毛豎起整體呈球狀，發(fā)病率達(dá)到100%；96 h處死后，可見(jiàn)胸肌、腿肌出血明顯，法氏囊腫大，漿膜層呈現(xiàn)黃色膠凍樣。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明，IBDV陽(yáng)性血清與IBDV標(biāo)準(zhǔn)抗原和回歸試驗(yàn)雞的法氏囊組織勻漿之間均出現(xiàn)沉淀線，而與陰性對(duì)照之間無(wú)沉淀線出現(xiàn)（圖1）。

圖1 傳染性法氏囊病病毒瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)Fig.1 AGID analysis of IBDV

2.3 VP2基因的擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)1條約1 373 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期片段大小一致；將構(gòu)建好的p ET28a－VP2用Eco RⅠ、Hin dⅢ雙酶切可以切出約1 373 bp的條帶（圖3），說(shuō)明VP2基因已經(jīng)克隆到p ET28a載體上，陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序后正確。

2.4 VP2基因原核表達(dá)及鑒定

將含有陽(yáng)性質(zhì)粒的宿主菌，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 nm為0.8時(shí)，IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.5 mmol／L，溫度30℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間8 h；以未誘導(dǎo)的宿主菌及誘導(dǎo)的p ET28a空載體做為對(duì)照組。將菌體處理后進(jìn)行SDS－PAGE，結(jié)果在48 ku處出現(xiàn)目的條帶（圖4），而且以可溶的形式存在；West－ern blot的結(jié)果表明VP2蛋白可與抗雞IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5）。說(shuō)明VP2基因被正確表達(dá)，且具有反應(yīng)原性。

2.5 VP2蛋白的免疫原性分析

3周齡SPF雞免疫接種后2周，翅下采血分離血清按對(duì)倍比稀釋后進(jìn)行瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，疫苗免疫組的效價(jià)可以達(dá)到23，對(duì)照組無(wú)效價(jià)（圖6）。說(shuō)明VP2蛋白免疫接種后可以引起機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)IBDV的中和性抗體。

3 討論

VP2蛋白占病毒衣殼蛋白總量的51% ，是IBDV的主要宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)與識(shí)別、病毒毒力的變異、病毒的抗原漂變、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)［4］；因此利用VP2來(lái)開(kāi)發(fā)基因工程疫苗成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前VP2基因在大腸埃希菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、禽痘病毒、腺病毒、火雞皰疹病毒等表達(dá)系統(tǒng)中得到成功表達(dá)，利用其制備的 DNA 疫苗［5－6］、亞 單位疫 苗［7－8］、病毒活 載體疫苗免疫保護(hù)效果已經(jīng)得到證實(shí)［9－10］。

本研究以大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的IBDV VP2蛋白作為抗原制備成油乳劑疫苗，免疫接種2周齡SPF雞能誘導(dǎo)SPF雞產(chǎn)生抗IBDV免疫力。說(shuō)明通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白具有生物學(xué)活性，只要以適宜水平、適當(dāng)接種次數(shù)、適當(dāng)途徑（肌肉注射和皮下注射）刺激機(jī)體就可以產(chǎn)生較高的抗體水平。

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