張勤文，俞紅賢，荊海霞，李 莉，魏 青，牛海林，薛 乾，梁 林

（青海大學農牧學院動物醫(yī)學系，青海西寧810016）

骨骼肌有氧呼吸獲能的水平高低，不僅與動物心血管系統(tǒng)的結構特征有關，而且與骨骼肌本身的微血管密度、肌細胞中肌紅蛋白的含量有關，微血管密度高，可以縮短氧從毛細血管向組織彌散的距離，改善組織供氧量，是組織、細胞對低氧環(huán)境的一種適應性反應。齊新章等［1］在對高原鼢鼠和高原鼠兔的微血管密度研究后發(fā)現(xiàn)，盡管同為高原動物，二者的心肌微血管密度差異顯著（P＜0.05），這是由于二者不同生活方式造成的，高原鼢鼠骨骼肌主要以紅肌纖維為主，挖掘、取食時主要依靠有氧呼吸，而不像鼠兔在躲避天敵時急速奔跑，以無氧呼吸為主，故而需要更多的氧氣，而高微血管密度則為高原鼢鼠的氧氣供應提高了巨大的支持。

牦牛耐勞，善走陡坡險路、雪山沼澤，有“高原之舟”之稱，在高原低氧環(huán)境中運動能力極強，既有快速奔跑能力，又有持續(xù)運動能力，深入研究牦牛骨骼肌的肌纖維類型和微血管密度，將會揭示牦牛適應高原低氧環(huán)境的組織形態(tài)學特點。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗動物分別來自于青海大通種牛場（海拔3 200 m）含四分之一野血大通牦牛（以下簡稱大通牦牛）和山東省萊蕪地區(qū)（海拔500 m以下）平原黃牛（以下簡稱平原黃牛），大通牦牛和平原黃牛均選取四個年齡段（1日齡、30日齡、180日齡和成年），每個年齡段各5頭，臨床健康，不計性別。

1.2 方法

1.2.1 取材及樣品處理 試驗動物現(xiàn)場屠宰后立即取材。每頭牛取股四頭肌一塊，所有試驗動物取材部位相同。采取的組織40 g／L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm間隔連續(xù)切片，明膠片貼片。

1.2.2 心肌微血管密度測定 切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗3 min×3，0.01 mol／L 的 PBS沖洗3 min×3，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中修復抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗3 min×3，滴加30 mL／L H2O2室溫孵育，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3 min×3，滴加50 mL／L的封閉液，不洗，滴加兔抗牛CD34多克隆抗體，4℃過夜。PBS沖洗3 min×3，滴加生物素化山羊抗兔工作液（1∶200）稀釋，PBS沖洗3 min×3，滴加試劑SABC，室溫孵育10 min。PBS沖洗3 min×3，DAB顯色劑顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，待有陽性細胞出現(xiàn)，且背景淡時即可用蒸餾水終止反應，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

切片按 Weidner N等［2］方法，每張選取熱點區(qū)拍照。Olympus DP70圖像采集系統(tǒng)（日本）取圖，采用Image－Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（德國）分析。

所測數據要經過校準才可進行對比，即骨骼肌微血管密度／骨骼肌表面積密度，所得比值來衡量單位肌纖維中所含微血管數的多少。

2 結果

2.1 不同發(fā)育階段骨骼肌微血管密度的變化

現(xiàn)有研究中，在進行骨骼肌微血管密度的比較時，絕大多數學者均是進行動物間的橫向比較，而對骨骼肌微血管密度的發(fā)育學變化較少研究。因此，為了能夠準確的體現(xiàn)出大通牦牛和平原黃牛骨骼肌微血管密度，將單位面積內測得的微血管數與肌纖維表面積密度的比值作為衡量微血管密度的指標，相對合理和科學。

2.1.1 不同發(fā)育階段大通牦牛骨骼肌微血管密度的變化 免疫組織化學染色切片結果見圖1～圖8。由表1可知，大通牦牛骨骼肌微血管密度占單位數量骨骼肌纖維的比值，隨著年齡的增長，總體表現(xiàn)為上升的趨勢，但在30日齡先降到一個相對低點，即0.819±0.045，然后逐漸升高，到成年時達到最高，即1.383±0.061。各年齡段的微血管密度與單位數量骨骼肌纖維的比值，兩兩相比差異極顯著（P＜0.01）。

2.1.2 不同發(fā)育階段平原黃牛骨骼肌微血管密度的變化 由表1可知，平原黃牛骨骼肌微血管密度占單位數量骨骼肌纖維的比值，隨著年齡的增長，總體表現(xiàn)為上升的趨勢，但在30日齡先降到一個相對低點，即0.750±0.039，然后逐漸升高，到成年時達到最高，即1.304±0.074。各年齡段的微血管密度與單位數量骨骼肌纖維的比值，除1日齡和30日齡相比差異不顯著外（P＞0.05），其余各組兩兩相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 30日齡大通牦牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of Datong yak at 30 d age（400×）

圖3 180日齡大通牦牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.3 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of Datong yak at 180 d age（400×）

圖4 成年大通牦牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.4 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of Datong yak at adult（400×）

圖5 1日齡平原黃牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.5 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of plain cattle at 1 d age（400×）

圖6 30日齡平原黃牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.6 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of plain cattle at 30 d age（400×）

圖7 180日齡平原黃牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.7 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of plain cattle at 180 d age（400×）

圖8 成年平原黃牛骨骼肌CD34免疫組化染色（400×）Fig.8 Immunohistochemical staining of CD34 in skeletal muscle of plain cattle at adult（400×）

表1 大通牦牛和平原黃牛骨骼肌微血管密度Table1 The microvessel densities in skeletal muscle of yak and cattle

2.2 同一發(fā)育階段大通牦牛與平原黃牛骨骼肌微血管密度的比較

由表1可以看出，同一年齡階段大通牦牛與平原黃牛骨骼肌肌纖維微血管密度兩兩相比時，差異極顯著（P＜0.01）。且均表現(xiàn)為隨著年齡的增長，骨骼肌微血管密度總體呈現(xiàn)上升的趨勢。

3 討論

有學者對缺氧時骨骼肌毛細血管增生存在爭議。Snyder G K 等［3］研 究 發(fā) 現(xiàn)，SD 大 鼠 在350 mm Hg環(huán)境生活1月后，骨骼肌微血管密度無明顯變化。而 Sillau A H 等［4－5］研究后認為，慢性缺氧時，骨骼肌纖維萎縮、變細造成了微血管密度增加。黃慶愿［6］在對大鼠進行常氧對照組、單純缺氧組和缺氧運動組的研究后指出，動物在缺氧環(huán)境下運動，使骨骼肌氧供需嚴重失衡，可能是引起骨骼肌微血管增生的基礎。而動物單純缺氧時，由于紅細胞數的增加及肌纖維萎縮使氧的供應相對增多，而動物在缺氧環(huán)境中的活動量減少，使骨骼肌對氧的需求相對減少，這樣氧的供需失衡現(xiàn)象不嚴重，因此微血管不出現(xiàn)增生。

本研究中，大通牦牛骨骼肌微血管密度，隨著年齡的增長整體表現(xiàn)為上升的趨勢，說明在大通牦牛發(fā)育過程中，隨著骨骼肌的生長，不斷增粗，運動能力的增強，骨骼肌的需氧量逐漸增大，機體通過增加骨骼肌微血管密度來增強氧的運送和利用能力。這種變化，是機體對高原低氧環(huán)境的一種適應性變化。毛細血管增生，可以縮短氧從毛細血管向組織彌散的距離，改善組織供氧量，是組織、細胞對低氧環(huán)境的一種適應性反應。組織代謝的需要與組織微血管的分布存在因果關系，組織代謝的需要決定組織微血管的密度與分布。黃慶愿［6］的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧運動組骨骼肌微血管增加的同時，血管內皮生長因子的量也顯著增加；單純缺氧組骨骼肌微血管并沒有顯著增生，VEGF的量也未見明顯變化。因此，在缺氧環(huán)境中運動，可促進微血管的增生。

在缺氧過程中，組織的需要是微血管密度增加的基礎。黃慶愿報道［6］，大鼠在模擬5 000 m高原4周，可見毛細血管密度增加或毛細血管與肌纖維的比值增加，出生并生長于3 500 m的大鼠心肌毛細血管與肌纖維比值可從平原的1.01增加到1.72，表明慢性缺氧條件下的運動可引起心肌毛細血管增生。本研究中，大通牦牛骨骼肌微血管密度，均比相同發(fā)育階段黃牛高，且差異極顯著（P＜0.01）。主要原因是大通牦牛生活在高海拔低氧地區(qū)，為了得到充足的食物，保證自身生存的需要，在一年中隨著季節(jié)的變化，逐水草而居，運動性能良好，骨骼肌在運動過程中需要大量氧氣供應以滿足機體需要，大通牦牛通過增加骨骼肌微血管密度來增加肌肉對氧的攝取和利用，提高適應高原低氧環(huán)境的能力。在長期對低氧環(huán)境的良好適應后，微血管密度高的特點作為生物學性狀固定下來，并且通過遺傳傳遞給下一代。

［1］齊新章，王曉君，朱世海，等.高原鼢鼠和高原鼠兔心臟對低氧環(huán)境的適應［J］.生理學報，2008，60（3）：348－354.

［2］Weidner N，Semple J P，Welch W R，et al.Tumor angiogenesis and metastasis－correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med，1991，324：1－8.

［3］Snyder G K，Wilcox E E，Burnham E W.Effects of hypoxia on muscle capillarity in rats［J］.Respir Physiol，1985，62：135－140.

［4］Sillau A H，Aquin L，Bui M V，et al.Chronic hypoxia does not affect guines pig skeletal muscle capillarity［J］.Pflueger Arch，1980，386（1）：39－45.

［5］Hoppeller H，Kleiner T E，Schlegel C，et al.Morphological adaptations of human skeletal mscle to chronic hypoxia［J］.Int J Sports Med，1990，11（suppl 1）：S3－9.

［6］黃慶愿.低氧習服大鼠骨骼肌毛細血管密度和血流供應的變化特點［J］.中國應用生理學雜志，2001，17（3）：220－223.