楊朋艷，梁晚楓，張守發(fā)，賈立軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002）

附紅細胞體?。‥perythrozoonosis）簡稱附紅體病，是由附紅細胞體（Eperythrozoon）感染機體后，附著于人和動物紅細胞表面或游離于血漿及骨髓中所引起的人獸共患的傳染性疾病。該病多為隱性感染，急性發(fā)病時以發(fā)熱、貧血和黃疸為主要臨床表現(xiàn)。我國是目前該病流行最為嚴重的國家之一，相繼報道本病流行的省、市、自治區(qū)已有20多個［1］。該病不僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，動物生育能力下降，而且還可導(dǎo)致動物出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，甚至死亡［2］，已經(jīng)對畜牧業(yè)發(fā)展及人類健康構(gòu)成了嚴重威脅，是一種亟待控制的傳染?。?］。本研究對自然感染豬附紅細胞體長白仔豬進行了血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的測定，以期為該病的臨床診斷和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 采自延邊某豬場，35日齡左右的長白仔豬20頭。

1.1.2 試劑 r Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、DNA提取試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原體鑒定

1.2.1.1 姬姆薩染色 頸靜脈無菌采集仔豬血液抗凝劑抗凝，滴1滴于潔凈的載玻片上，抹片，自然干燥后，甲醇固定，姬姆薩染色12 h，鏡下觀察豬附紅細胞體的感染情況。

1.2.1.2 PCR檢測 根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細胞體膜蛋白OxaA序列（CBZ40902.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0和 Oligo 6.0軟件設(shè)計引物，上游引物 P1：5′－TCTTATGTCTTTGTTGTAAATCTG－3′；下游引物P2：5′－TTTTCAATCTATGTTCACCTCA－3′。擴增片段大小386 bp。擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃45 s，57℃45 s，72℃45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 血液學(xué)指標(biāo)的測定 使用全自動動物血液細胞分析儀，按常規(guī)方法進行檢測。

1.2.3 血清生化指標(biāo)的測定 使用全自動動物血液細胞分析儀，按常規(guī)方法進行檢測。

1.2.4 統(tǒng)計方法 各試驗數(shù)據(jù)均采用t檢驗方法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 姬姆薩染色鏡檢

經(jīng)過姬姆薩染色鏡檢，可見紅細胞呈紫紅色，豬附紅細胞體成實體狀態(tài)，有折光性（圖1）。感染豬附紅細胞體的紅細胞表面附著1個～5個不等。

2.2 PCR檢測

以被檢豬全血基因組DNA為模板，應(yīng)用特異性P1和P2引物，經(jīng)PCR擴增獲得386 bp的目的基因片段，與預(yù)期大小一致（圖2）。

圖1 豬附紅細胞體姬姆薩染色（1 000×）Fig.1 Giemsa staining of Eperythrozoon suis（1 000×）

2.3 仔豬血液學(xué)指標(biāo)的測定結(jié)果

對仔豬進行紅細胞數(shù)（RBC）、白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、血 紅 蛋 白 （HGB）、平 均 紅 細 胞 體 積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板數(shù)目（PLT）、血小板壓積（PCT）、紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）等指標(biāo)的測定。結(jié)果自然感染豬附紅細胞體病的仔豬的WBC、PLT、PCT、RDW、MPV 升高，RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PDW等指標(biāo)降低，表現(xiàn)出患病仔豬有貧血傾向（表1）。

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，以上各項指標(biāo)顯性感染階段和陰性值相比差異極顯著（P＜0.01），隱性感染階段和顯性感染階段相比差異極顯著（P＜0.01），RBC、HGB、MCV、PLT、RDW 隱性感染階段和陰性值相比差異顯著（P＜0.05），其余指標(biāo)隱性感染階段和陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

對仔豬進行白細胞分類計數(shù)，淋巴細胞（LYM）、中性粒細胞（GRAN）、單核細胞（MON）。結(jié)果，自然感染豬附紅細胞體病的仔豬的LYM（%）升高，GRAN（%）降低，MON（%）無明顯變化（表2）。

表1 仔豬血液學(xué)指標(biāo)變化情況Table1 Hematology index changes in piglets

表2 仔豬白細胞分類計數(shù)Table2 White blood cell counts in piglets

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，LYM、GRAN、MON顯性感染階段與陰性值相比差異顯著（P＜0.05），隱性感染階段和顯性感染階段相比差異顯著（P＜0.05），隱性感染階段和陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 仔豬血清生化指標(biāo)的測定結(jié)果

對仔豬進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、肌酐（CRE）、總膽固醇（TC）、尿素氮（BUN）等指標(biāo)的測定。結(jié)果，自然感染豬附紅細胞體病的仔豬的ALT、AST、ALP、CRE顯著升高，BUN降低，其余指標(biāo)無明顯變化（表3）。

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，顯性感染階段 ALT、AST、ALP、GGT、CRE、BUN與陰性值相比差異極顯著（P＜0.01），隱性感染階段 ALT、AST、ALP、GGT、CRE、BUN與陰性值相比差異顯著（P＜0.05），其余指標(biāo)與陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

豬附紅細胞體病可使不同年齡的豬發(fā)病，但對仔豬的危害較為嚴重［4－7］。因此，本試驗以長白仔豬為對象，在姬姆薩染色鏡檢和PCR技術(shù)鑒定病原體的前提下，對自然感染豬附紅細胞體長白仔豬的血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)進行了檢測。通過對仔豬的血液生理生化指標(biāo)的測定，明確了豬附紅細胞體可引起紅細胞數(shù)、紅細胞壓積、血紅蛋白等降低，白細胞總數(shù)升高，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等酶活性升高，而對血糖、甘油三酯、總膽固醇等指標(biāo)無影響。

表3 仔豬血清生化指標(biāo)的變化情況Table3 Seral biochemical index changes in piglets

PCR檢測法具有極高的敏感性和特異性，可以用于檢測急性豬附紅細胞體病和臨床健康的帶菌豬［8］。由于PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點，它已成為診斷豬附紅細胞體病的一種有效手段。因此，本試驗在姬姆薩染色鏡檢病原體的基礎(chǔ)上，又進行了PCR鑒定，使試驗更為嚴謹，結(jié)果更為準確。

目前，關(guān)于豬附紅細胞體病的防治，尚未有效的藥物和疫苗，所采取的防控措施也只能在一定程度上實施，不能從根本上解決問題［9－10］。而且，隨著豬附紅細胞體病的廣泛流行，豬附紅細胞體的致病性和抗原性出現(xiàn)了明顯的變異情況，給該病的臨床診斷帶來了極大困難，也給該病的深入研究帶來了嚴峻考驗［11］。因此，本試驗對現(xiàn)階段當(dāng)?shù)刈匀桓腥镜呢i附紅細胞體病長白仔豬進行了血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的檢測，旨在為豬附紅細胞體病的臨床診斷提供理論依據(jù)。

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