舒凡帆，董 輝，趙其平，李 婷，朱順海，韓紅玉，姜連連，孔春林，王 曄，薛 璞，鄒豐才，黃 兵＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

雞球蟲病是由艾美耳屬（Eimeria）球蟲引起的一種原蟲病，能引起雞生長發(fā)育停滯，飼料報(bào)酬降低，甚至死亡，對(duì)全球養(yǎng)雞業(yè)每年造成大約20億英鎊損失［1］。長期以來，抗球蟲藥是預(yù)防和控制球蟲病的主要方法，但藥物無節(jié)制的使用導(dǎo)致球蟲抗藥性的大量產(chǎn)生。另一方面，政府和消費(fèi)者希望藥物添加劑能逐步被淘汰。幸運(yùn)的是，用球蟲活疫苗來代替藥物已經(jīng)被證明是可行的方法，目前歐盟約80%的雞群是通過使用商品化球蟲活疫苗來免疫預(yù)防球蟲?。?］。

堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）對(duì)雞致病力中等，主要寄生于雞十二指腸，分布廣、感染率高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害僅次于柔嫩艾美耳球蟲［3］。在中國，堆型艾美耳球蟲是肉雞養(yǎng)殖中最常見的3種球蟲之一，也是球蟲活疫苗常包含的蟲種之一［4］。

通過前期研究，已獲得一株堆型艾美耳球蟲早熟株。該早熟株致病力比母株弱，免疫原性與母株相當(dāng)，遺傳穩(wěn)定性好，對(duì)7種常見抗球蟲藥物敏感［5－6］。本文擬研究該早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，為確定推薦免疫劑量和制備球蟲活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 二黃雞，購自上海市郊某孵化場。飼養(yǎng)于嚴(yán)格控制的無球蟲的隔離籠舍中，飼喂不添加任何抗球蟲藥的全價(jià)飼料。試驗(yàn)前連續(xù)2 d檢查糞便，確認(rèn)無球蟲感染。

1.1.2 蟲株 堆型艾美耳球蟲母株（資源號(hào)CAAS 2111101），由黃兵等用單卵囊分離技術(shù)分離于上海郊區(qū)某大型雞廠，潛在期99 h。堆型艾美耳球蟲早熟株（資源號(hào)CAAS 2111105），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所誘導(dǎo)獲得，潛在期84 h［5］。2個(gè)蟲株孢子化卵囊置于25 g／L的重鉻酸鉀溶液中4℃保存，試驗(yàn)前經(jīng)雞體傳代獲得新鮮卵囊后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 第一批試驗(yàn) 將480只6日齡雛雞逐只稱重，按每組30只雞隨機(jī)分為16組，調(diào)整各組體重基本相同。7日齡進(jìn)行首免，其中第1組～第7組用早熟株免疫，免疫劑量分別為每只雞100、200、400、600、800、1 000及2 000個(gè)孢子化卵囊；第8組～第14組用母株免疫，免疫劑量與早熟株相同。第15組為陽性對(duì)照組（不免疫攻蟲組），第16組為空白對(duì)照組（不免疫不攻蟲組）。14日齡進(jìn)行二免，各組免疫劑量與首免相同。二免后7 d稱重，計(jì)算6日齡～21日齡期間（免疫期間）各組的增重。除第16組外，各組分別用母株進(jìn)行攻蟲，劑量為每只雞15×104個(gè)孢子化卵囊。攻蟲后4 d～7 d，每天收集糞便稱重，用麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)法計(jì)每克糞便卵囊數(shù)（OPG），統(tǒng)計(jì)各組平均每只雞的卵囊排出總量，計(jì)算卵囊減少率。28日齡結(jié)束試驗(yàn)，逐只稱重、處死，取十二指腸進(jìn)行腸道病變記分，并計(jì)算21日齡～28日齡期間（攻蟲期間）的增重。試驗(yàn)期間觀察記錄各組雞的精神、食欲、飲水、發(fā)病、死亡及糞便狀況。

1.2.2 第二批試驗(yàn) 根據(jù)第一批試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)獲得的兩個(gè)免疫效果較好的劑量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。取120只雞稱重，按每組30只雞隨機(jī)分為4組，調(diào)整各組體重基本相同。第1組和第2組為第一批試驗(yàn)免疫效果較好的兩個(gè)免疫組，第3組為不免疫攻蟲組，第4組為不免疫不攻蟲組。7日齡首免，14日齡二免，21日齡稱重后，除了第4組外，其余各組每只雞接種母株20×104個(gè)孢子化卵囊。攻蟲后處理措施、試驗(yàn)周期等與第一批試驗(yàn)相同。

1.2.3 觀測指標(biāo) 用3項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷：①病變記分，依據(jù)腸道病變程度分別記為0～4分。②相對(duì)增重率，以攻蟲后7 d間各組的增重占不免疫不攻蟲組增重的百分率，即相對(duì)增重率＝（各組平均增重÷不免疫不攻蟲組平均增重）×100。③卵囊減少率，以各組平均每只雞在攻蟲后4 d～7 d排出卵囊量計(jì)算卵囊減少率，卵囊減少率＝（不免疫攻蟲組排出卵囊總量－免疫攻蟲組排出卵囊總量）÷不免疫攻蟲組排出卵囊總量×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組的相對(duì)增重及病變記分進(jìn)行方差分析，其中，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 第一批試驗(yàn)

堆型艾美耳球蟲早熟株試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，在增重方面，各免疫組在免疫期間的增重和不免疫組相當(dāng)（P＞0.05）；攻蟲期間免疫劑量為400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽的增重均與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05），其中600、800個(gè)／羽的增重更接近健康對(duì)照，而免疫劑量為100個(gè)／羽～200個(gè)／羽的增重明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，各免疫組病變記分相當(dāng)，均輕于感染對(duì)照組，但差異不顯著。在卵囊減少率方面，免疫劑量400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽的卵囊減少率超過90%，而免疫劑量100個(gè)／羽和200個(gè)／羽的卵囊減少率相對(duì)偏低。綜合免疫劑量、免疫期間與攻蟲期間的增重、卵囊減少率等指標(biāo)分析，擬將600、800個(gè)卵囊／羽作為堆型艾美耳球蟲早熟株的推薦免疫劑量，進(jìn)行第二批試驗(yàn)。

表1 堆型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table1 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina

堆型艾美耳球蟲母株試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，在增重方面，各免疫組在免疫期間的增重和健康組相當(dāng)（P＞0.05）；攻蟲后，免疫劑量為600個(gè)／羽～1 000個(gè)／羽的增重與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05），均明顯高于不免疫感染對(duì)照組（P＜0.05），而免疫劑量為100個(gè)／羽～400個(gè)／羽和2 000個(gè)／羽的增重均與不免疫感染組相當(dāng)。在腸道病變記分方面，各免疫組病變記分相當(dāng)，均輕于感染對(duì)照組，但差異不顯著。在卵囊減少率方面，免疫劑量400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽卵囊減少率高達(dá)90%以上，免疫劑量100個(gè)／羽和200個(gè)／羽在卵囊減少數(shù)量方面較差。

表2 堆型艾美耳球蟲母株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table2 The effectiveness of different immunizing dosages with parent strain of E.acervulina

2.2 第二批試驗(yàn)

堆型艾美耳球蟲早熟株免疫劑量600、800個(gè)／羽的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，各免疫組在免疫期間的增重與不免組相當(dāng)；攻蟲后，兩個(gè)免疫組的增重與健康對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），均明顯高于不免疫攻蟲組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，兩個(gè)免疫組均未出現(xiàn)病變，明顯低于感染對(duì)照組。在卵囊產(chǎn)量方面，兩個(gè)免疫組的卵囊減少率均在88%以上。結(jié)果再次表明，用堆型艾美耳球蟲早熟株600個(gè)／羽和800個(gè)／羽免疫后均可獲得良好的免疫保護(hù)效果。

表3 堆型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量重復(fù)試驗(yàn)保護(hù)效力Table3 The effectiveness of different immunizing dosages with precocious line of E.acervulina（Repeated）.

3 討論

球蟲感染宿主后可在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。自然感染中，雞球蟲的免疫原性主要在裂殖生殖階段，尤其是第2代裂殖生殖階段，而有性生殖階段幾乎沒有免疫原性。對(duì)于堆型艾美耳球蟲，主要是在第2代裂殖生殖階段誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量免疫力［7］。與母株相比，堆型艾美耳球蟲早熟株的生活史中缺少第3、4代裂殖子［8］。因此，堆型艾美耳球蟲早熟株在不影響其免疫原性的基礎(chǔ)上通過減少配子體和卵囊形成數(shù)量而降低致病性。本試驗(yàn)以母株作為對(duì)照，對(duì)堆型艾美耳球蟲早熟株的免疫原性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，該早熟株的免疫原性與同等劑量的母株相當(dāng)，表明其保持了良好的免疫原性，這與已有的研究一致［7］。

雞感染球蟲后，對(duì)同種球蟲再感染獲得部分保護(hù)力。但球蟲誘發(fā)宿主免疫力強(qiáng)弱、持續(xù)時(shí)間長短隨種類的不用而異，基本取決于各自的生物學(xué)特點(diǎn)。研究表明，堆型艾美耳球蟲的免疫原性介于巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲之間，可使雞產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)力。但堆型艾美耳球蟲不同株之間存在遺傳變異，說明其不同株之間的免疫原性存在著明顯差異。為了研制球蟲活疫苗，需要對(duì)疫苗蟲株的推薦免疫劑量進(jìn)行研究。已有研究表明雞獲得的保護(hù)性免疫效果與球蟲的免疫劑量存在相關(guān)性。免疫劑量越大，其抗攻擊能力越強(qiáng)，但免疫劑量過大，則導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞大量損傷而難以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，影響飼料的轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益；免疫劑量過小，使基礎(chǔ)免疫量減少，不能有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫力抵抗大劑量的攻蟲，容易造成疫苗反應(yīng)加劇或球蟲病暴發(fā)［8］。因此，需要在不同免疫劑量之間找到推薦免疫劑量。但由于至今尚無判定球蟲推薦免疫劑量的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者采用的判定指標(biāo)不同。華紹桂等［9－10］以成活率、費(fèi)用、料重比、均重、飼料指數(shù)等5項(xiàng)指標(biāo)，Long P L等以增重和病變記分等2項(xiàng)指標(biāo)，本試驗(yàn)選用增重、病變記分和卵囊減少率等3項(xiàng)指標(biāo)作為判定指標(biāo)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用堆型艾美耳球蟲早熟株和母株免疫雛雞后都能產(chǎn)生一定的保護(hù)能力，攻蟲后二者的指標(biāo)規(guī)律性一致。比較二者增重，發(fā)現(xiàn)100個(gè)／羽～200個(gè)／羽小劑量免疫時(shí)，增重明顯低于健康對(duì)照（P＜0.05）；用400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽免疫時(shí)，除了母株2000個(gè)／羽的增重明顯低于健康對(duì)照組之外，其余各組均與健康對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05）。這可能是100個(gè)／羽和200個(gè)／羽免疫劑量過小，不能使雞產(chǎn)生足夠的基礎(chǔ)免疫力；免疫母株2 000個(gè)／羽對(duì)免疫雞具有較強(qiáng)的致病作用，其生長受到影響，由于早熟株的致病性弱于母株，其對(duì)免疫雞只的增重影響較小。在攻蟲后，400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽各免疫組的卵囊減少率都超過90%，各組病變記分均輕于感染對(duì)照組，表明雞只免疫后能獲得較高的免疫保護(hù)力。在400個(gè)／羽～2 000個(gè)／羽免疫組中，綜合增重、病變記分和卵囊減少率三個(gè)判定指標(biāo)，600個(gè)／羽和800個(gè)／羽的免疫組效果最好。低于或者高于該免疫劑量都使增重和卵囊減少率呈下降趨勢。綜合考慮到一個(gè)好的疫苗應(yīng)該是低劑量免疫、重復(fù)感染、保護(hù)效果好、副作用少、成本低等因素，建議將600個(gè)／羽作為堆型艾美耳球蟲早熟株的推薦免疫劑量，該劑量也與已有研究基本一致。McDougald L R等［11］研制的堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲三價(jià)疫苗中，堆型艾美耳球蟲的免疫劑量為500個(gè)／羽。國外商品化球蟲疫苗Paracox?中，堆型艾美耳球蟲的免疫劑量為500個(gè)／羽～650個(gè)／羽。

本文研究了實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的堆型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，初步擬定了制作疫苗的推薦免疫劑量，為研制球蟲疫苗提供參考。但該劑量是在實(shí)驗(yàn)室條件下用單個(gè)蟲株對(duì)籠養(yǎng)雞只進(jìn)行免疫獲得的，該蟲株與其他蟲種復(fù)配后制成疫苗的免疫保護(hù)效果還有待進(jìn)一步研究。

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