潘 波，楊春曉，楊志富，李成剛，朱小源，楊健源，馮愛卿，劉二明，譚新球

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125；3.廣東省植物保護研究所，廣東 廣州 510640）

近年來，隨著全球氣候的變化和耕作制度的改革，稻曲病在我國水稻生產(chǎn)區(qū)的發(fā)生呈逐年加重趨勢，其中雜交稻的發(fā)病最為明顯。稻曲病是由Ustilaginoidea virens（Cooke）Tak.引起的真菌病害[1]，該病的致病菌是一種既可危害水稻有對人畜產(chǎn)生毒害作用的真菌，日本科學家己從稻曲球中分離得到了6 種毒素，其中毒素A 毒性最強[2-3]。

盡管稻曲病已經(jīng)引起研究人員的高度重視，但是目前的研究僅限于該病的化學防治、病菌人工接種技術、部分基礎生物學特性等方面[4]，對其病原菌的侵染過程、抗性水稻品種的抗病機制，以及病原菌致病能力與水稻品種的親和作用等方面尚未見報道。為探討不同水稻品種（品系）與不同來源的稻曲病病菌之間是否存在親和性互作，以可能具有抗稻曲病的水稻品種和不同地域來源的病原菌為材料展開研究，以期完善水稻品種（品系）對稻曲病的抗性鑒定評價體系，并為水稻抗稻曲病育種和水稻品種田間合理布局提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

將田間采集的新鮮稻曲球按文獻[5]進行預處理，再參照文獻[6-8]進行分離純化得到單胞，保存?zhèn)溆?。通過rDNA-ITS 序列分析確認菌株，并結合相關生物學特性（菌絲生長速率、色素、產(chǎn)孢量）進行比較分析，選取產(chǎn)孢量大的11 個菌株接種作為供試菌株（表1）。

表1 供試稻曲病菌株

1.2 供試水稻品種

2010年，廣東省植物保護研究所利用人工接種技術在室內(nèi)和田間對水稻品種進行了抗性鑒定，選取其中對菌株UV0901 顯示抗性的恢4、恢9、恢17、恢19、恢21、恢24、恢27、黃15、金優(yōu)207、豐源優(yōu)299 作供試品種，以田間稻曲病發(fā)病率較高的兩優(yōu)培九和岳優(yōu)9113 作易感品種。

2011年5月4日將水稻材料播種于湖南省植物保護研究所的試驗田中，不同材料之間進行隔離，苗齡30 d 左右進行移栽，每個品種栽植60 叢，每行5 叢，共12 行，田間施肥水平按照超高產(chǎn)栽培模式進行[9]，害蟲和雜草按照常規(guī)管理。為保證試驗結果的可靠性，生長期間不使用任何殺菌劑。

1.3 接種液制備

將純化的供試稻曲病菌株打孔轉接到50 mL PS 液體培養(yǎng)液（含硫酸鏈霉素50 μg/mL），每瓶接種2 塊，于28±1℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，為避免薄壁分生孢子的損傷，保證分生孢子正常萌發(fā)，先將培養(yǎng)液用雙層紗布過濾，得到孢子懸浮液與菌絲。將菌絲用搗碎機搗碎[10]，然后與孢子懸浮液混合（7.5×105個/mL），將混合液作為人工接種體置于冰上待用。

1.4 田間接種

于頭季稻孕穗期7～8 期（即水稻抽穗前5～9 d）進行人工接種，具體操作為：8月1～3日下午16∶00～18∶00 將接種液注射到穗部的近下部或上部，直到菌液從穗苞充滿溢出（通常每穗約2～3 mL）。每個品種菌株接種10 穗，同時注射清水作為對照。為保證最適發(fā)病條件，在氣溫超過30℃時進行噴水降溫，維持田間溫度在28℃左右，相對濕度（RH）90%以上。

頭季稻調(diào)查結束后及時收割水稻，注意保留地上部約10 cm 的稻莖，灌水并追施氮肥促使水稻再生，于再生稻抽穗前4～7 d 再次進行人工接種，具體步驟和操作方法同上。

1.5 田間調(diào)查和分級標準

分別于接種后第21 天和蠟熟期進行田間調(diào)查，統(tǒng)計接種稻穗的發(fā)病穗數(shù)、每穗發(fā)病病粒數(shù)以及每個品種稻穗的平均谷粒數(shù)，然后計算病穗率和平均病粒率。計算方法如下：

病穗率（%）=接種發(fā)病穗數(shù)總接種穗數(shù)×100%

平均病粒率（%）=總發(fā)病粒數(shù)發(fā)病穗數(shù)×品種每穗平均粒數(shù)×100%

根據(jù)病穗率和每穗發(fā)病病粒數(shù)初步確定相關供試水稻品種抗性反應，具體分級標準如下：接種稻穗的病穗率<1.00%，每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過1粒，定為0 級，屬于高抗（HR）；病穗率1.00%～5.00%，每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過3 粒，定為1 級，屬于抗性品種（R）；病穗率5.10%～10.00%，每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過5 粒，定為3 級，屬于中抗品種（MR）；病穗率10.10%～25.00%，每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過5 粒，定為5 級，屬于中感品種（MS）；病穗率25.10%～50.00%，每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過7 粒，定為7 級，屬于感病品種（S）；病穗率>50.00%或每稻穗發(fā)病粒數(shù)不超過7 粒，定為9 級，屬于高感品種（HS）；任何指標超過抗性級別相應移動。

2 結果與分析

2.1 頭季稻對不同菌株的抗性反應

頭季稻于2011年8月1～3日接種，采取水霧降溫保濕處理，但由于平均氣溫較高，接種后病穗率最高為70.00%（恢17 對菌株YN1012），平均病粒率最高為3.25%（恢17 對菌株HN1007），接種效果并不理想。但從總體來看，接種后同一水稻品種對不同接種菌株的抗性反應表現(xiàn)有一定的差異，同一菌株對不同水稻品種的抗性反應差異也較為明顯（詳見表2）。

2.2 再生稻對不同菌株的抗性反應

表2 不同供試水稻品種頭季稻對不同來源稻曲病病株的抗性反應

再生稻接種結果顯示接種成功率明顯比頭季稻高，病穗率均超過了90%，最高達100.00%，平均病粒率最高為8.14%。從水稻品種來看，恢4、恢17、恢21、恢24、黃15 和感病對照材料岳優(yōu)9113、兩優(yōu)培九對不同的菌株均表現(xiàn)為中度感病到高度感病，其中恢17 和黃15 對所有供試菌株表現(xiàn)為高感反應；而恢9、恢19、金優(yōu)207、豐源優(yōu)299 對不同來源的供試菌株表現(xiàn)的抗性反應從高感到免疫，相比較而言恢9 和金優(yōu)207 對50.00%供試菌株表現(xiàn)為免疫。從供試菌株來看，相同的菌株對不同供試品種抗性反應也表現(xiàn)為高感到免疫，如恢9 對菌株GD1001 表現(xiàn)為免疫，而金優(yōu)207 則表現(xiàn)為感??；恢9 對菌株GZ1001 表現(xiàn)為感病，而金優(yōu)207則表現(xiàn)為免疫等（詳見表3）。

表3 不同供試水稻品種再生稻對不同來源稻曲病菌株的抗性反應

3 討 論

研究結果表明：2010年在廣東省植物保護研究所利用菌株UV0901 進行人工接種鑒定的抗性材料，在不同環(huán)境條件下抗性反應發(fā)生明顯改變，這與水稻稻瘟病抗性鑒定一樣，抗性材料可能只在特定區(qū)域內(nèi)具有抗性[18]。另外，同一供試水稻品種對不同來源的稻曲病菌株的抗性反應差異明顯，可能是因為不同菌株對寄主有選擇性致病差異；而頭季稻和再生稻對同一菌株的抗性反應存在明顯差異，可能是由于不同生長季節(jié)氣候條件變化影響了病菌的致病力引起的；對于同一來源的菌株，不同水稻品種的抗性反應存在差異，表明不同水稻品種與稻曲病菌株之間存在親和性互作特性，具體作用機理還有待進一步研究。

供試材料頭季稻接種的效率明顯低于再生稻季，除接種氣候因素影響外，可能與再生稻生長發(fā)育迅速、生育期相對較短、營養(yǎng)供應充足等因素有關，具體原因還有待進一步研究。僅從上述結果來看，利用水稻頭季稻和再生稻連續(xù)進行人工接種，來鑒定和評價水稻的稻曲病抗性，可以縮短抗性鑒定周期，同時可進一步確定不同氣候條件下，品種抗性是否穩(wěn)定。

致謝：

真誠感謝王疏、胡東維、陳志誼、李少杰老師和胡茂林博士贈送稻曲病菌株。衷心感謝廣東農(nóng)科院植物保護研究所的朱小源、楊健源、陳深和馮愛卿老師的長期協(xié)同合作及贈送水稻材料。

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