酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ难芯?/h1>
2012-09-25 03:16:24孫莉群謝玉忠劉海燕孟凡坤
大慶師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2012年3期
孫莉群，謝玉忠，劉海燕，孟凡坤
(1.大慶師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 大慶 163712； 2.延邊大學(xué) 理學(xué)院，吉林 延吉 133002)
0 引言
面包酵母可以不對稱還原β-羰基酯生成具有光學(xué)活性的β-羥基酯[1]。這類手性醇是許多手性藥物合成的關(guān)鍵手性中間體，如它們是合成β-內(nèi)酰胺類藥物[2]、昆蟲信息素和類胡蘿卜素[2]等手性產(chǎn)品的關(guān)鍵手性砌塊[3]。關(guān)于面包酵母催化羰基酯不對稱還原反應(yīng)的研究已有很多報(bào)道[4-5]，但這類研究主要集中在酵母容易催化且光學(xué)選擇性較高的乙酰乙酸乙酯的還原。本文以2-乙?；嵋阴シ磻?yīng)為模型底物考察其在水相體系中酵母細(xì)胞催化該類底物不對稱還原的反應(yīng)特性。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 材料和試劑
鮮酵母，分別由湖北安琪酵母公司、河北馬利酵母公司、廣東丹寶利酵母公司、河北榮和酵母公司生產(chǎn)。2-乙酰基庚酸乙酯(本實(shí)驗(yàn)室合成)；十二烷(A.R.)(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；手性位移試劑Et(tfc)3(FLuka公司)；硼氫化鈉，葡萄糖，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，乙酸乙酯等為市售分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 菌體的預(yù)處理
將購得的鮮面包酵母用適量pH=7.0的磷酸緩沖溶液(0.0667mol/L)洗滌兩次，1200r×10min離心收集，離心得到的菌體保存于4℃的冰箱中備用。
1.2.2 酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴?/p>
稱取一定量的濕菌體(菌體的干濕比為1g干菌體/2.8g濕菌體，通過把一定量的濕菌體在120℃烘箱中烘干至恒重得到)懸浮于10mL 0.0667mol/L的磷酸緩沖液中，加入一定量的葡萄糖或其他輔助底物，在搖床中振蕩1小時(shí)，使面包酵母充分活化，再向緩沖液中加入底物2-乙?；嵋阴?，在搖床中恒溫反應(yīng)一定時(shí)間。
1.2.3 產(chǎn)物的分離與分析
反應(yīng)一定時(shí)間后，取反應(yīng)混合液加入10mL有機(jī)溶劑萃取并攪拌30min，離心1200r ×10min收集有機(jī)層，接下來在混合液中加入10mL有機(jī)溶劑，超聲波中作用30min，離心收集有機(jī)層，合并上述有機(jī)層，加入無水Na2SO4充分干燥，減壓蒸出溶劑。用氣相色譜分析產(chǎn)物和底物濃度，以十二烷為內(nèi)標(biāo)物定量分析。色譜條件：SE-54為固定相的毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為99.99%高純氮?dú)猓V柱恒溫115℃，柱前壓為0.1MPa，尾吹為0.044MPa，分流進(jìn)樣，分流比1∶50，進(jìn)樣器和檢測器溫度分別為225℃和260℃。利用WZZ-2S型數(shù)字式自動旋光儀測定產(chǎn)物旋光值，旋光管長10cm。同時(shí)將提純后產(chǎn)物與手性位移試劑Et(tfc)3作用，利用測NMR方法來測定其光學(xué)純度。
2 結(jié)果與討論
2.1 幾種酵母還原2-乙?；嵋阴ツ芰Φ谋容^
分別取2g 濕菌體(安琪酵母、燕山酵母、丹寶利酵母、榮和酵母、馬利酵母)懸浮于pH=7.0，磷酸緩沖液(0.0667mol/L)中加入0.1g葡萄糖30℃搖床活化1小時(shí)后，加入0.03g底物2-乙?；嵋阴?，在搖床中恒溫反應(yīng)24h，并測定其轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖1所示?？梢妿追N酵母都具有一定的還原能力，其中，安琪酵母、馬利酵母、榮和酵母還原能力較強(qiáng)，下面將繼續(xù)做進(jìn)一步研究。
2.2 反應(yīng)條件的初步確定
影響酵母不對稱還原反應(yīng)的因素較多，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酵母濃度、底物濃度、能源供體等都可影響反應(yīng)的結(jié)果，同時(shí)各因素又相互制約。為縮小研究范圍，我們在大量單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酵母濃度、底物濃度、反應(yīng)pH值、碳源量、酵母種類七個因素建立三水平七因素正交實(shí)驗(yàn)(L1837)，考察其對反應(yīng)的影響，考察的指標(biāo)是2-乙?；嵋阴サ霓D(zhuǎn)化率，正交試驗(yàn)結(jié)果如表1，極差分析結(jié)果見圖2和表2。
圖1 幾種酵母還原能力的比較 圖2 L1837正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果
表1 面包酵母細(xì)胞催化2-乙酰基庚酸乙酯還原反應(yīng)的(L1837)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2 2-乙?；嵋阴マD(zhuǎn)化率的極差分析
對2-乙酰基庚酸乙酯的轉(zhuǎn)化率而言，表1結(jié)果表明最高轉(zhuǎn)化率是實(shí)驗(yàn)1的91.17%，但是表2的極差分析表明實(shí)驗(yàn)1并不是最佳條件。從極差分析結(jié)果可知，在所選取的三水平七因素范圍內(nèi)，底物轉(zhuǎn)化率的最佳條件是反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間24h，pH=7.0，底物濃度10mmol/L，碳源量10g/L，酵母濃度200g/L，三種酵母中馬利酵母轉(zhuǎn)化率最高。因此，在后面的實(shí)驗(yàn)中我們?nèi)窟x用了馬利酵母。七種因素中底物濃度為主要影響因素，其余因素的影響次序?yàn)榉磻?yīng)溫度、酵母細(xì)胞濃度、酵母種類、反應(yīng)時(shí)間、pH值、碳源量。
同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，底物濃度在較低時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，隨著酵母濃度增加轉(zhuǎn)化率變大。因此，我們考慮在一定的底物濃度下，是否能夠通過提高酵母濃度來提高底物的轉(zhuǎn)化率，以提高反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率。下一步我們選擇影響因素較大的底物濃度、反應(yīng)溫度、酵母細(xì)胞濃度為研究對象。
2.3 不同初始底物濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響
對于生物催化，底物濃度通常對反應(yīng)有較大的影響，反應(yīng)體系中不同底物的初始濃度可能對酵母細(xì)胞催化羰基不對稱還原的反應(yīng)活性有一定的影響，因此，在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們又做了單因素試驗(yàn)，固定其他條件不變，提高酵母濃度為300 g/L，底物2-乙?；嵋阴サ某跏紳舛确謩e分10、15、20、25、30和35mmol/L，得到的轉(zhuǎn)化率變化如圖3所示。
可以看出，底物濃度低于10mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，隨著底物2-乙酰基庚酸乙酯濃度的升高，轉(zhuǎn)化率不斷下降，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?0mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率小于91.6%。這與歐志敏[6]的研究結(jié)果類似，這是因?yàn)樵诖朔磻?yīng)體系中，酵母細(xì)胞和底物是最基本的構(gòu)成因素，當(dāng)酵母細(xì)胞濃度一定時(shí)，酶的活性部位的數(shù)目是固定的，其酶活性部位所能接納的底物量也就確定了，因此面包酵母的濃度一定時(shí)底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的量基本不變。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾雍?，底物可能會對酵母?xì)胞存在抑制作用，氧化還原酶的活力降低，導(dǎo)致反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率迅速下降。當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，但是底物的轉(zhuǎn)化量較低，因此，從反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率角度考慮20mmol/L的底物濃度最佳。
2.4 反應(yīng)體系溫度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙酰基庚酸乙酯的影響
以微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過程，實(shí)質(zhì)上是以酶作為催化劑的生物轉(zhuǎn)化過程，而溫度則是酶催化反應(yīng)的一個很重要的影響因素。因此，溫度對生物的轉(zhuǎn)化有著較大的影響[7]。實(shí)驗(yàn)考察了在25℃～40℃的范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度對反應(yīng)的影響。
圖3 不同初始底物濃度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ挠绊?/p>
圖4 反應(yīng)溫度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ挠绊?/p>
由圖4可以看出，溫度對底物的轉(zhuǎn)化率影響很大，在25℃～30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，催化底物反應(yīng)的酶活性增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大。30℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)最高值。溫度繼續(xù)增加轉(zhuǎn)化率顯著下降，這是因?yàn)榉磻?yīng)處于較高的溫度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)某些酶的活性會受到抑制，這既可能是較高的溫度抑制了細(xì)胞內(nèi)輔酶NAD(P)H再生的代謝過程，也可能是較高的溫度抑制了還原酶的活性。Nakamura.[8]對酵母細(xì)胞中催化β-羰基酯不對稱還原的酶進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)這些酶在40℃下不太穩(wěn)定，有一定程度的失活。因此，可以確定在較高的溫度下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率降低的主要原因是抑制了細(xì)胞內(nèi)還原酶的活性?？紤]以上影響因素，選擇30℃作為下面反應(yīng)的溫度。
2.5 反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響
在利用微生物細(xì)胞立體選擇性轉(zhuǎn)化制備2-( 1-羥基乙基)-庚酸乙酯的過程中，真正起催化作用的是細(xì)胞中的酶或酶系。因此，反應(yīng)體系中的菌體量會直接影響參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而影響最終的轉(zhuǎn)化效果。實(shí)驗(yàn)考察了底物濃度為20mmol/L時(shí)，酵母濃度從50g/L到400g/L對反應(yīng)的影響。
圖5 反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響
由圖5可以看出，隨著酵母細(xì)胞濃度的增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大，細(xì)胞濃度為300g/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.6%。而繼續(xù)提高酵母細(xì)胞濃度底物的轉(zhuǎn)化率提高不大。原因是反應(yīng)中起催化作用的是酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶(E)，酶先與底物(S)作用形成中間體ES，最后生成產(chǎn)物P。
中間體ES的生成速率與酶濃度有關(guān)，酶濃度高，則ES的生成速率快，這有利于產(chǎn)物的生成，但當(dāng)k3>>k1時(shí)，酶濃度的進(jìn)一步提高僅加快了ES的生成速率，對產(chǎn)物的生成速率影響較小。另一方面，當(dāng)面包酵母濃度增加時(shí)，氧化還原酶濃度提高的同時(shí)，酵母中乳化劑等輔助物的濃度也會增加，這些物質(zhì)的增加將降低底物2-乙?；嵋阴ピ诜磻?yīng)體系中的分散性，從而減小酶與底物的作用，限制了底物的轉(zhuǎn)化。細(xì)胞濃度高于300g/L時(shí)，雖然可以提高轉(zhuǎn)化率，但是單位菌體的轉(zhuǎn)化能力下降，轉(zhuǎn)化率的提高非常有限。因此，確定全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度為300g/L。
2.6 產(chǎn)品的純化及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果
在上述優(yōu)化條件下，大量合成了產(chǎn)物，通過萃取回收的產(chǎn)物中往往含有少量的乳化劑和酵母細(xì)胞自溶放出的雜質(zhì)等，因此需對萃取的粗產(chǎn)品進(jìn)一步分離純化。由于活性炭對產(chǎn)品的吸附能力同雜質(zhì)相等，采用活性碳很難除去，選擇用柱層析方法進(jìn)行純化。
通過TLC分析，確定以二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行多次柱層析，除去粗產(chǎn)物中的雜質(zhì)，收集Rf=0.37組分，減壓濃縮得產(chǎn)品。通過測紅外譜圖和1H-NMR譜圖，結(jié)果表明為目標(biāo)產(chǎn)物。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ/ppm: 4.19(q,2H)，3.93(m,1H)，2.34(m,1H) ，2.42(m,1H),1.57(m,2H)，1.19(m,9H)，1.17(d , J=9.03,3H)，0.855(t，3H)
手性位移試劑Et(tfc)3的1H-NMR譜圖結(jié)果如圖6、圖7，我們發(fā)現(xiàn)通過和手性位移試劑作用，與-OH相連的-CH-的化學(xué)位移發(fā)生偏移，化學(xué)法產(chǎn)物和生物法產(chǎn)物對于與-OH相連的-CH-的積分值不同，化學(xué)法產(chǎn)物兩種氫的積分比為1∶1，生物法產(chǎn)物兩種氫的積分比為1∶1.9，說明，也證明了生物法產(chǎn)物具有一定光學(xué)活性。
圖6 化學(xué)法產(chǎn)物衍生化1H-NMR譜圖
圖7 生物法產(chǎn)物衍生化1H-NMR譜圖
3 結(jié)語
本文研究了酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ姆磻?yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水相中酵母細(xì)胞經(jīng)過簡單的處理可以用于2-乙酰基庚酸乙酯的不對稱還原反應(yīng)，在所取的酵母中在相同條件下馬利生產(chǎn)的酵母的還原能力較好，酵母底物的轉(zhuǎn)化率較高，反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率角度考慮，20mmol/L的初始底物濃度最佳，轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.8%；通過提高酵母濃度能夠提高底物的轉(zhuǎn)化率，隨著酵母細(xì)胞濃度的增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大，細(xì)胞濃度大于300g/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率提高不大；產(chǎn)品的純化后結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明，酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ漠a(chǎn)物同化學(xué)法還原產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相同，為目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)測定具有光學(xué)活性，同時(shí)反應(yīng)的立體選擇性控制有待于進(jìn)一步研究。
[參考文獻(xiàn)]
[1] 曾嶸,楊忠華,姚善涇. 生物催化碳羥基不對稱還原合成手性醇的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2004 ,23(11) ：1169-1173.
[2] Tschaen D M, Fuentes L M,Lynch J E, et al. An Efficient Synthesis of 4- Benzoyloxyazetidinone: an Important Carbapenem Intermediate[J]. Tetrahedron Lett.,1988, 29(23): 2779-2782.
[3] 張玉彬. 生物催化的手性合成[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.
[4] Mon K. Synthesis of Optically Active Pheromones[J]. Tetrahedron,1989,45(11): 3233-3298.
[5] Katja Goldberg,Kirsten Sehroer,et al,Andreas Liese.Biocatalytic ketone reduetion-a powerful tool for the production of Chiral alcohols-part II:whole-cell reductions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76(2):249-255.
[6] 歐志敏.微生物法還原羰基化合物制備手性藥物中間體的研究[D].杭州：浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2003.
[7] 陳石根,周潤琦.酶學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.
[8] Nakamura K, Kawai Y, Nakajima N, et al.A Method for Controlling the Enantioselectivity of Reductions with Baker’s Yeast[J]. J. Org. Chem,1991,56(15):4778-4783.
孫莉群，謝玉忠，劉海燕，孟凡坤
(1.大慶師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 大慶 163712； 2.延邊大學(xué) 理學(xué)院，吉林 延吉 133002)
0 引言
面包酵母可以不對稱還原β-羰基酯生成具有光學(xué)活性的β-羥基酯[1]。這類手性醇是許多手性藥物合成的關(guān)鍵手性中間體，如它們是合成β-內(nèi)酰胺類藥物[2]、昆蟲信息素和類胡蘿卜素[2]等手性產(chǎn)品的關(guān)鍵手性砌塊[3]。關(guān)于面包酵母催化羰基酯不對稱還原反應(yīng)的研究已有很多報(bào)道[4-5]，但這類研究主要集中在酵母容易催化且光學(xué)選擇性較高的乙酰乙酸乙酯的還原。本文以2-乙?；嵋阴シ磻?yīng)為模型底物考察其在水相體系中酵母細(xì)胞催化該類底物不對稱還原的反應(yīng)特性。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 材料和試劑
鮮酵母，分別由湖北安琪酵母公司、河北馬利酵母公司、廣東丹寶利酵母公司、河北榮和酵母公司生產(chǎn)。2-乙酰基庚酸乙酯(本實(shí)驗(yàn)室合成)；十二烷(A.R.)(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；手性位移試劑Et(tfc)3(FLuka公司)；硼氫化鈉，葡萄糖，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，乙酸乙酯等為市售分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 菌體的預(yù)處理
將購得的鮮面包酵母用適量pH=7.0的磷酸緩沖溶液(0.0667mol/L)洗滌兩次，1200r×10min離心收集，離心得到的菌體保存于4℃的冰箱中備用。
1.2.2 酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴?/p>
稱取一定量的濕菌體(菌體的干濕比為1g干菌體/2.8g濕菌體，通過把一定量的濕菌體在120℃烘箱中烘干至恒重得到)懸浮于10mL 0.0667mol/L的磷酸緩沖液中，加入一定量的葡萄糖或其他輔助底物，在搖床中振蕩1小時(shí)，使面包酵母充分活化，再向緩沖液中加入底物2-乙?；嵋阴?，在搖床中恒溫反應(yīng)一定時(shí)間。
1.2.3 產(chǎn)物的分離與分析
反應(yīng)一定時(shí)間后，取反應(yīng)混合液加入10mL有機(jī)溶劑萃取并攪拌30min，離心1200r ×10min收集有機(jī)層，接下來在混合液中加入10mL有機(jī)溶劑，超聲波中作用30min，離心收集有機(jī)層，合并上述有機(jī)層，加入無水Na2SO4充分干燥，減壓蒸出溶劑。用氣相色譜分析產(chǎn)物和底物濃度，以十二烷為內(nèi)標(biāo)物定量分析。色譜條件：SE-54為固定相的毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為99.99%高純氮?dú)猓V柱恒溫115℃，柱前壓為0.1MPa，尾吹為0.044MPa，分流進(jìn)樣，分流比1∶50，進(jìn)樣器和檢測器溫度分別為225℃和260℃。利用WZZ-2S型數(shù)字式自動旋光儀測定產(chǎn)物旋光值，旋光管長10cm。同時(shí)將提純后產(chǎn)物與手性位移試劑Et(tfc)3作用，利用測NMR方法來測定其光學(xué)純度。
2 結(jié)果與討論
2.1 幾種酵母還原2-乙?；嵋阴ツ芰Φ谋容^
分別取2g 濕菌體(安琪酵母、燕山酵母、丹寶利酵母、榮和酵母、馬利酵母)懸浮于pH=7.0，磷酸緩沖液(0.0667mol/L)中加入0.1g葡萄糖30℃搖床活化1小時(shí)后，加入0.03g底物2-乙?；嵋阴?，在搖床中恒溫反應(yīng)24h，并測定其轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖1所示?？梢妿追N酵母都具有一定的還原能力，其中，安琪酵母、馬利酵母、榮和酵母還原能力較強(qiáng)，下面將繼續(xù)做進(jìn)一步研究。
2.2 反應(yīng)條件的初步確定
影響酵母不對稱還原反應(yīng)的因素較多，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酵母濃度、底物濃度、能源供體等都可影響反應(yīng)的結(jié)果，同時(shí)各因素又相互制約。為縮小研究范圍，我們在大量單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酵母濃度、底物濃度、反應(yīng)pH值、碳源量、酵母種類七個因素建立三水平七因素正交實(shí)驗(yàn)(L1837)，考察其對反應(yīng)的影響，考察的指標(biāo)是2-乙?；嵋阴サ霓D(zhuǎn)化率，正交試驗(yàn)結(jié)果如表1，極差分析結(jié)果見圖2和表2。
圖1 幾種酵母還原能力的比較 圖2 L1837正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果
表1 面包酵母細(xì)胞催化2-乙酰基庚酸乙酯還原反應(yīng)的(L1837)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2 2-乙?；嵋阴マD(zhuǎn)化率的極差分析
對2-乙酰基庚酸乙酯的轉(zhuǎn)化率而言，表1結(jié)果表明最高轉(zhuǎn)化率是實(shí)驗(yàn)1的91.17%，但是表2的極差分析表明實(shí)驗(yàn)1并不是最佳條件。從極差分析結(jié)果可知，在所選取的三水平七因素范圍內(nèi)，底物轉(zhuǎn)化率的最佳條件是反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間24h，pH=7.0，底物濃度10mmol/L，碳源量10g/L，酵母濃度200g/L，三種酵母中馬利酵母轉(zhuǎn)化率最高。因此，在后面的實(shí)驗(yàn)中我們?nèi)窟x用了馬利酵母。七種因素中底物濃度為主要影響因素，其余因素的影響次序?yàn)榉磻?yīng)溫度、酵母細(xì)胞濃度、酵母種類、反應(yīng)時(shí)間、pH值、碳源量。
同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，底物濃度在較低時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，隨著酵母濃度增加轉(zhuǎn)化率變大。因此，我們考慮在一定的底物濃度下，是否能夠通過提高酵母濃度來提高底物的轉(zhuǎn)化率，以提高反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率。下一步我們選擇影響因素較大的底物濃度、反應(yīng)溫度、酵母細(xì)胞濃度為研究對象。
2.3 不同初始底物濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響
對于生物催化，底物濃度通常對反應(yīng)有較大的影響，反應(yīng)體系中不同底物的初始濃度可能對酵母細(xì)胞催化羰基不對稱還原的反應(yīng)活性有一定的影響，因此，在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們又做了單因素試驗(yàn)，固定其他條件不變，提高酵母濃度為300 g/L，底物2-乙?；嵋阴サ某跏紳舛确謩e分10、15、20、25、30和35mmol/L，得到的轉(zhuǎn)化率變化如圖3所示。
可以看出，底物濃度低于10mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，隨著底物2-乙酰基庚酸乙酯濃度的升高，轉(zhuǎn)化率不斷下降，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?0mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率小于91.6%。這與歐志敏[6]的研究結(jié)果類似，這是因?yàn)樵诖朔磻?yīng)體系中，酵母細(xì)胞和底物是最基本的構(gòu)成因素，當(dāng)酵母細(xì)胞濃度一定時(shí)，酶的活性部位的數(shù)目是固定的，其酶活性部位所能接納的底物量也就確定了，因此面包酵母的濃度一定時(shí)底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的量基本不變。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾雍?，底物可能會對酵母?xì)胞存在抑制作用，氧化還原酶的活力降低，導(dǎo)致反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率迅速下降。當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，但是底物的轉(zhuǎn)化量較低，因此，從反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率角度考慮20mmol/L的底物濃度最佳。
2.4 反應(yīng)體系溫度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙酰基庚酸乙酯的影響
以微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過程，實(shí)質(zhì)上是以酶作為催化劑的生物轉(zhuǎn)化過程，而溫度則是酶催化反應(yīng)的一個很重要的影響因素。因此，溫度對生物的轉(zhuǎn)化有著較大的影響[7]。實(shí)驗(yàn)考察了在25℃～40℃的范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度對反應(yīng)的影響。
圖3 不同初始底物濃度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ挠绊?/p>
圖4 反應(yīng)溫度對酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ挠绊?/p>
由圖4可以看出，溫度對底物的轉(zhuǎn)化率影響很大，在25℃～30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，催化底物反應(yīng)的酶活性增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大。30℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)最高值。溫度繼續(xù)增加轉(zhuǎn)化率顯著下降，這是因?yàn)榉磻?yīng)處于較高的溫度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)某些酶的活性會受到抑制，這既可能是較高的溫度抑制了細(xì)胞內(nèi)輔酶NAD(P)H再生的代謝過程，也可能是較高的溫度抑制了還原酶的活性。Nakamura.[8]對酵母細(xì)胞中催化β-羰基酯不對稱還原的酶進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)這些酶在40℃下不太穩(wěn)定，有一定程度的失活。因此，可以確定在較高的溫度下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率降低的主要原因是抑制了細(xì)胞內(nèi)還原酶的活性?？紤]以上影響因素，選擇30℃作為下面反應(yīng)的溫度。
2.5 反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響
在利用微生物細(xì)胞立體選擇性轉(zhuǎn)化制備2-( 1-羥基乙基)-庚酸乙酯的過程中，真正起催化作用的是細(xì)胞中的酶或酶系。因此，反應(yīng)體系中的菌體量會直接影響參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而影響最終的轉(zhuǎn)化效果。實(shí)驗(yàn)考察了底物濃度為20mmol/L時(shí)，酵母濃度從50g/L到400g/L對反應(yīng)的影響。
圖5 反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響
由圖5可以看出，隨著酵母細(xì)胞濃度的增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大，細(xì)胞濃度為300g/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.6%。而繼續(xù)提高酵母細(xì)胞濃度底物的轉(zhuǎn)化率提高不大。原因是反應(yīng)中起催化作用的是酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶(E)，酶先與底物(S)作用形成中間體ES，最后生成產(chǎn)物P。
中間體ES的生成速率與酶濃度有關(guān)，酶濃度高，則ES的生成速率快，這有利于產(chǎn)物的生成，但當(dāng)k3>>k1時(shí)，酶濃度的進(jìn)一步提高僅加快了ES的生成速率，對產(chǎn)物的生成速率影響較小。另一方面，當(dāng)面包酵母濃度增加時(shí)，氧化還原酶濃度提高的同時(shí)，酵母中乳化劑等輔助物的濃度也會增加，這些物質(zhì)的增加將降低底物2-乙?；嵋阴ピ诜磻?yīng)體系中的分散性，從而減小酶與底物的作用，限制了底物的轉(zhuǎn)化。細(xì)胞濃度高于300g/L時(shí)，雖然可以提高轉(zhuǎn)化率，但是單位菌體的轉(zhuǎn)化能力下降，轉(zhuǎn)化率的提高非常有限。因此，確定全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系中酵母細(xì)胞濃度為300g/L。
2.6 產(chǎn)品的純化及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果
在上述優(yōu)化條件下，大量合成了產(chǎn)物，通過萃取回收的產(chǎn)物中往往含有少量的乳化劑和酵母細(xì)胞自溶放出的雜質(zhì)等，因此需對萃取的粗產(chǎn)品進(jìn)一步分離純化。由于活性炭對產(chǎn)品的吸附能力同雜質(zhì)相等，采用活性碳很難除去，選擇用柱層析方法進(jìn)行純化。
通過TLC分析，確定以二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行多次柱層析，除去粗產(chǎn)物中的雜質(zhì)，收集Rf=0.37組分，減壓濃縮得產(chǎn)品。通過測紅外譜圖和1H-NMR譜圖，結(jié)果表明為目標(biāo)產(chǎn)物。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ/ppm: 4.19(q,2H)，3.93(m,1H)，2.34(m,1H) ，2.42(m,1H),1.57(m,2H)，1.19(m,9H)，1.17(d , J=9.03,3H)，0.855(t，3H)
手性位移試劑Et(tfc)3的1H-NMR譜圖結(jié)果如圖6、圖7，我們發(fā)現(xiàn)通過和手性位移試劑作用，與-OH相連的-CH-的化學(xué)位移發(fā)生偏移，化學(xué)法產(chǎn)物和生物法產(chǎn)物對于與-OH相連的-CH-的積分值不同，化學(xué)法產(chǎn)物兩種氫的積分比為1∶1，生物法產(chǎn)物兩種氫的積分比為1∶1.9，說明，也證明了生物法產(chǎn)物具有一定光學(xué)活性。
圖6 化學(xué)法產(chǎn)物衍生化1H-NMR譜圖
圖7 生物法產(chǎn)物衍生化1H-NMR譜圖
3 結(jié)語
本文研究了酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ姆磻?yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水相中酵母細(xì)胞經(jīng)過簡單的處理可以用于2-乙酰基庚酸乙酯的不對稱還原反應(yīng)，在所取的酵母中在相同條件下馬利生產(chǎn)的酵母的還原能力較好，酵母底物的轉(zhuǎn)化率較高，反應(yīng)的時(shí)-空產(chǎn)率角度考慮，20mmol/L的初始底物濃度最佳，轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.8%；通過提高酵母濃度能夠提高底物的轉(zhuǎn)化率，隨著酵母細(xì)胞濃度的增加，底物的轉(zhuǎn)化率增大，細(xì)胞濃度大于300g/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率提高不大；產(chǎn)品的純化后結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明，酵母細(xì)胞不對稱還原2-乙?；嵋阴サ漠a(chǎn)物同化學(xué)法還原產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相同，為目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)測定具有光學(xué)活性，同時(shí)反應(yīng)的立體選擇性控制有待于進(jìn)一步研究。
[參考文獻(xiàn)]
[1] 曾嶸,楊忠華,姚善涇. 生物催化碳羥基不對稱還原合成手性醇的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2004 ,23(11) ：1169-1173.
[2] Tschaen D M, Fuentes L M,Lynch J E, et al. An Efficient Synthesis of 4- Benzoyloxyazetidinone: an Important Carbapenem Intermediate[J]. Tetrahedron Lett.,1988, 29(23): 2779-2782.
[3] 張玉彬. 生物催化的手性合成[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.
[4] Mon K. Synthesis of Optically Active Pheromones[J]. Tetrahedron,1989,45(11): 3233-3298.
[5] Katja Goldberg,Kirsten Sehroer,et al,Andreas Liese.Biocatalytic ketone reduetion-a powerful tool for the production of Chiral alcohols-part II:whole-cell reductions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76(2):249-255.
[6] 歐志敏.微生物法還原羰基化合物制備手性藥物中間體的研究[D].杭州：浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2003.
[7] 陳石根,周潤琦.酶學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.
[8] Nakamura K, Kawai Y, Nakajima N, et al.A Method for Controlling the Enantioselectivity of Reductions with Baker’s Yeast[J]. J. Org. Chem,1991,56(15):4778-4783.
