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        液體發(fā)酵樹(shù)舌提取凝集素的生理學(xué)功能檢測(cè)

        2012-09-25 01:29:06張春玉劉黎紅邵佳甲逯家富
        關(guān)鍵詞:吉林長(zhǎng)春凝集素菌絲體

        張春玉,宋 凱,劉黎紅,邵佳甲,逯家富

        (1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院,吉林長(zhǎng)春 130033;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130024;3.長(zhǎng)春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130032)

        液體發(fā)酵樹(shù)舌提取凝集素的生理學(xué)功能檢測(cè)

        張春玉1,2,宋 凱3,劉黎紅1,邵佳甲1,逯家富1

        (1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院,吉林長(zhǎng)春 130033;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130024;3.長(zhǎng)春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130032)

        本文對(duì)樹(shù)舌菌絲體的深層發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,樹(shù)舌菌絲體在大豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天,產(chǎn)出的總蛋白、總糖含量較高。從發(fā)酵液中分離和純化出樹(shù)舌凝集素具有明顯的生物學(xué)活性。

        樹(shù)舌;液體發(fā)酵;凝集素

        20世紀(jì)60年代,人們就開(kāi)始從真菌中提取生物活性物質(zhì),如多糖、多糖蛋白復(fù)合物、凝集素、核糖失活蛋白、多肽、嘌呤和三萜類等,并評(píng)價(jià)它們的抗腫瘤和抗病毒活性[1-2]。在這種需求下,真菌有效成分的獲取成為研究的熱點(diǎn)[3-5]。

        傳統(tǒng)方法都是通過(guò)野外采集或是人工栽培種植真菌子實(shí)體等,缺點(diǎn)是生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、品質(zhì)不易控制。1947年,Humfeld發(fā)明了深層發(fā)酵技術(shù),使真菌具有可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)、產(chǎn)量高、周期短、易于控制、質(zhì)量穩(wěn)定、相對(duì)容易進(jìn)行提取分離等優(yōu)點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)首先以樹(shù)舌菌絲體為材料,對(duì)其深層發(fā)酵工藝的最優(yōu)化條件進(jìn)行研究。并對(duì)發(fā)酵液的有效成分凝集素進(jìn)行提取分離,通過(guò)凝血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其生理學(xué)功能。

        1 材料

        1.1 菌株

        樹(shù)舌菌種購(gòu)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所。

        1.2 培養(yǎng)基

        YPG培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1(或麥芽糖15 g·L-1),MgSO40.5 g·L-1,KH2PO41 g·L-1。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加瓊脂粉15 g·L-1。110℃高壓滅菌30min。

        不同配比花生和大豆培養(yǎng)基的配制如下表,高壓滅菌30min。

        表1 不同培養(yǎng)基的成分配比 g·L-1

        2 方法

        2.1 接種及培養(yǎng)

        樹(shù)舌菌種活化培養(yǎng)一周后,切取約1cm2的菌絲體小塊接種到以上6種液體培養(yǎng)基中,26℃搖床中,150rpm振蕩培養(yǎng),分別重復(fù)4組。

        2.2 樹(shù)舌菌絲體總蛋白含量的測(cè)定

        (1)分別取每種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體干樣100mg,液氮中迅速研磨成細(xì)粉。

        (2)加入到1ml預(yù)冷的10mMpH 7.4的PBS溶液中,4℃冰箱中放置24 h。

        (3)12000rpm離心20 min。

        (4)去除上清,將沉淀物用1ml預(yù)冷PBS緩沖液重新懸浮、離心。(5)取3和4步驟一次。

        (6)BCA試劑盒法測(cè)定每種菌絲體中總蛋白含量。

        2.3 樹(shù)舌菌絲體總糖含量的測(cè)定

        (1)分別取每種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體干樣100mg,液氮中迅速研磨成細(xì)粉。

        (2)樣品懸浮于25ml的80%的乙醇溶液中,95℃回流提取4h。

        (3)回流后的混合液12000rpm離心20min。

        (4)25ml熱水重新溶解沉淀,95℃回流提取2 h。

        (5)取混合液12000rpm離心15min,取上清液。

        (6)苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。

        2.4 樹(shù)舌菌絲體總生物量的測(cè)定

        取一定量的發(fā)酵液3000rpm離心10 min。蒸餾水洗滌沉淀后置于55℃烘干稱重。

        2.5 樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液pH值的測(cè)定

        每天測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

        2.6 凝集素粗提液的制備和活性檢測(cè)

        稱取液體培養(yǎng)的樹(shù)舌菌絲體60g(鮮重),加入10mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)置冰箱浸泡24h,經(jīng)高速搗碎機(jī)勻漿后,4層紗布過(guò)濾,濾液在3500r/min條件下離心20min,收集上清液,即得粗提液。

        2.7 血細(xì)胞凝集活性的實(shí)驗(yàn)

        按照凝血活性測(cè)定法,在“V”型血凝板上,在“V”型血凝板中加入25μl的生理鹽水,取凝集素粗提液(濃度為1mg·ml-1)25μl作倍比稀釋,每孔加入2%的血球懸液。搖動(dòng)血凝板使溶液混勻,血凝板在室溫放置1.5~2h,顯微鏡下檢測(cè)觀察結(jié)果。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 總蛋白和總糖含量比較

        蛋白質(zhì)和多糖是大型真菌食用和藥用價(jià)值的重要成分[7],本實(shí)驗(yàn)將樹(shù)舌菌絲體分別接種于不同成分配比的花生和大豆液體培養(yǎng)基中,對(duì)所得的菌絲體的總蛋白含量、總糖含量進(jìn)行了測(cè)定。圖1給出了樹(shù)舌在大豆液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),獲得總蛋白量都略高于或等于在花生培養(yǎng)基中的,且在加入20 g·L-1原料時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)最好,總蛋白含量最高。

        圖1 不同濃度配比的大豆和花生培養(yǎng)基培養(yǎng)樹(shù)舌中總蛋白含量比較

        總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸方法,并以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各樣品測(cè)得的平均OD值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,求得總糖的含量。如圖1所示,糖含量的變化與蛋白量變化相一致,大豆培養(yǎng)基要優(yōu)于花生培養(yǎng)基,且在20 g·L-1原料時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)最好。

        圖2 不同濃度配比的大豆和花生培養(yǎng)基培養(yǎng)樹(shù)舌中總糖含量比較

        3.2 樹(shù)舌菌絲體總生物量

        參照前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),選取最優(yōu)的花生培養(yǎng)基(20 g·L-1)進(jìn)行總生物量的測(cè)定。樹(shù)舌菌絲體在26℃條件下,110轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)數(shù)在搖床上振蕩培養(yǎng),其生長(zhǎng)曲線近似“S”型(圖3)。接種初期菌絲體生長(zhǎng)很快,從第二天就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,直至第五天達(dá)到閾值。隨后生長(zhǎng)速度放緩,可能是經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)的最高峰后培養(yǎng)基里的一些菌絲體代謝物產(chǎn)生了抑制的效果。7天后可見(jiàn)呈球狀的菌絲體(圖4)。

        圖3 樹(shù)舌菌絲體生長(zhǎng)曲線

        圖4 深層發(fā)酵培養(yǎng)的樹(shù)舌菌絲體

        3.3 樹(shù)舌靈芝菌發(fā)酵液中pH值的變化

        樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液的pH值變化見(jiàn)圖5,pH值在最初的兩天有略下降的趨勢(shì),到了第三天迅速降低。結(jié)合上面的生長(zhǎng)曲線分析,是由于在生長(zhǎng)旺盛的階段,菌絲體產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì),直至發(fā)酵的第六天,這時(shí)菌絲體生長(zhǎng)基本穩(wěn)定,pH值也穩(wěn)定在4.0~4.5之間。這說(shuō)明,隨著生長(zhǎng)狀態(tài)的變化,樹(shù)舌菌絲體為了使環(huán)境適應(yīng)自身的生長(zhǎng)代謝,對(duì)酸堿度進(jìn)行了自我調(diào)節(jié)。

        圖5 樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液pH值的變化曲線

        3.4 凝血實(shí)驗(yàn)

        真菌凝集素的細(xì)胞凝集作用是凝集素分子的一個(gè)亞基與一個(gè)細(xì)胞表面的凝集素專一識(shí)別的糖基結(jié)合,另一個(gè)亞基與另一個(gè)細(xì)胞上的糖基結(jié)合,從而通過(guò)凝集素的“架橋”作用而導(dǎo)致的本試驗(yàn)中[8-9],樹(shù)舌菌絲體粗提液經(jīng)血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)有凝血活性,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6左側(cè)A為實(shí)驗(yàn)樣品,右側(cè)B為對(duì)照組(以0.9%NaCl作陰性對(duì)照)。這表明在這種發(fā)酵條件下,獲得的凝集素具有良好的生理學(xué)活性。

        圖6 凝集素對(duì)血細(xì)胞的凝血反應(yīng)的顯微照片

        4 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)對(duì)樹(shù)舌菌絲體的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)設(shè)定不同氮源、氮源不同含量、不同的發(fā)酵時(shí)間,對(duì)其總蛋白含量、總糖含量進(jìn)行測(cè)定比較,確定了20 g·L-1的大豆培養(yǎng)基最為樹(shù)舌菌絲體大規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)更為優(yōu)良。在這種情況下,發(fā)酵的生物量變化和發(fā)酵液pH值變化相一致,且發(fā)酵5天時(shí),樹(shù)舌菌絲體生長(zhǎng)狀態(tài)最為良好,此時(shí)提取凝集素具有明顯的凝血活性。

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        Physiologic Function Tests on the Extraction of Lectin from Liquid Fermentation Ganoderma

        ZHANGChun-yu1,2,SONGKai3,LIULi-hong1,SHAOJia-jia1,LUJia-fu1
        (1.School ofFood Production Technologyand Biotechnology,Changchun Vocational Institute ofTechnology, Changchun 130033,China;2.School ofLife Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China; 3.School ofLife Sciences,Changchun Normal University,Changchun 130032,China)

        This paper studies the deep fermentation process of the Ganoderma mycelium preliminarily.Test results showthat after 5 days of cultivation in soybean agar,the Ganoderma mycelium’s total protein and total sugar content is higher,and the lectin ofGanoderma isolated and purified fromfermentation liquid has obvious biological activity.

        Ganoderma;liquid fermentation;lectin

        O625

        A

        1008-178X(2012)09-0069-05

        2012-06-15

        吉林省教育廳項(xiàng)目(2010第480號(hào))。

        張春玉(1972-),女,吉林長(zhǎng)春人,長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院副教授,博士,從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

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