張 麗 娜, 孫 玉 梅, 曹 方, 何 丹

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

草莓屬薔薇科多年生草本植物,營養(yǎng)豐富[1],具有保健功能[2]。草莓酒精發(fā)酵過程伴隨微生物群落復(fù)雜短暫的動態(tài)變化[3],這些微生物包括水果表面和釀酒設(shè)備中的細菌和酵母菌[4],并不是單一菌屬或單一菌株[5]。影響草莓酒發(fā)酵過程中微生物種群數(shù)量的因素有很多,如草莓品種,果實的部位,生產(chǎn)工藝,初始細胞濃度,溫度和SO2等[6]。SO2作為抑菌劑,可選擇性地抑制不利于草莓酒精發(fā)酵的微生物,保證發(fā)酵順利進行。有學者認為游離SO2通過主動運輸或自由擴散的形式被非釀酒酵母菌吸收,通過擾亂其基本的生物途徑而起到抑菌作用[7-8]。還有研究認為,酒醪中加入SO2后,酵母菌處于不可培養(yǎng)的狀態(tài)但仍有活性[9]。但到目前為止,SO2對草莓酒精發(fā)酵過程中微生物種群變化的影響尚未見報道。

本工作采用平板涂布培養(yǎng)法研究了不同SO2添加量的酵母強化草莓發(fā)酵過程中微生物種群數(shù)量的動態(tài)變化,測定了草莓發(fā)酵醪的還原糖、可溶性固形物、滴定酸、游離SO2和總SO2的含量以及pH等相關(guān)參數(shù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

草莓,豐香草莓,購于大連果品市場；酵母菌,本實驗室篩選自草莓自然發(fā)酵醪,經(jīng)鑒定為裂殖酵母屬[10]；果膠酶,酶活力200萬U/g,河南洛陽夏盛果汁果膠酶有限公司；亞硫酸,天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 酵母菌種子液的制備

一級種子液:從YEPD斜面上挑取2環(huán)酵母菌,接入5 mL 10%的葡萄糖溶液中,于30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

二級種子液:將一級種子液接入100 mL的草莓汁中,于30 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h,使酵母菌數(shù)達到1.5×108～2.0×108cells/mL。

1.3 酵母強化的草莓發(fā)酵過程

選擇無病斑的草莓,手工去萼,壓榨取汁,添加0.05%的果膠酶,45 ℃酶解90 min。取300 mL酶解后的草莓漿裝入無菌的500 mL三角瓶中,分別調(diào)整漿液中SO2質(zhì)量濃度為0、60、120、180、240 mg/L。按5%接種量接入酵母菌二級種子液,于25 ℃發(fā)酵14 d。

1.4 微生物種群數(shù)量測定

1.4.1 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)采用肉湯培養(yǎng)基,酵母菌采用YEPD培養(yǎng)基,霉菌采用察氏培養(yǎng)基；乳酸菌培養(yǎng)基:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、K2HPO4·3H2O 0.2%、乙酸鈉0.5%、葡萄糖2%、吐溫80 0.1%、檸檬酸二鈉0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·4H2O 0.025%、瓊脂1.8%、pH 6.2～6.4；醋酸菌培養(yǎng)基:葡萄糖1%、酵母膏1%、碳酸鈣2%、無水乙醇3%、瓊脂1.8%、50 mg/L制霉菌素,pH自然[11]。

1.4.2 微生物種群數(shù)量測定

在草莓發(fā)酵過程中,定期采集上、下層發(fā)酵醪樣品,用稀釋平板涂布法分別對不同微生物進行培養(yǎng),定期觀測微生物種群數(shù)量。

1.5 理化分析

1.5.1 取樣方法

在草莓發(fā)酵過程中,定期采集均勻的發(fā)酵醪樣品,分別進行不同理化指標的測定。

1.5.2 測定方法

還原糖測定:采用菲林滴定法[12]；可溶性固形物測定:利用WHT-5型手持糖量折光儀；滴定酸測定:采用酸堿滴定法[12]；pH測定:利用PHS-3C型pH計；酒精度測定:采用蒸餾比重法[12]；游離SO2及總SO2測定:采用直接碘量法[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母強化的草莓發(fā)酵醪的微生物種群變化

定期從不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪上、下層取樣,分別測定酵母菌、細菌和霉菌的數(shù)量,結(jié)果如圖1～3所示。

草莓屬溫濕性植物,生長環(huán)境決定草莓鮮果表面附有大量的酵母菌、細菌和霉菌[13]。由圖1～3可見,發(fā)酵醪上、下層的酵母菌、細菌、霉菌各自的生長曲線均相似,只是數(shù)量有所不同。在發(fā)酵初期,發(fā)酵醪上層酵母菌和細菌可利用的氧氣(醪中溶解氧以及液面上的氣態(tài)氧)充足,得以快速繁殖,數(shù)量較下層多；在發(fā)酵后期,液面上的氣態(tài)氧被較多消耗,上、下層的酵母菌和細菌可利用的氧氣量差別不大,表現(xiàn)出數(shù)量差別不大。在發(fā)酵初期的發(fā)酵醪中,營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧較多,酵母菌和細菌的數(shù)量較快增多。發(fā)酵4～6 d后,營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累等環(huán)境變化使酵母菌進入生長穩(wěn)定期,細菌的數(shù)量逐漸減少。這與李子自然發(fā)酵過程的菌群變化相似[6]。草莓發(fā)酵醪中的少量霉菌則快速減少直至消失,其中在發(fā)酵醪下層比在上層消失提前2天,估計也是可利用氧氣量的差別所致。未檢測到醋酸菌和乳酸菌。

(a) 上層發(fā)酵醪

(b) 下層發(fā)酵醪

圖1 不同SO2添加量草莓發(fā)酵醪中酵母菌數(shù)量的變化

Fig.1 Changes of yeast numbers in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

(a) 上層發(fā)酵醪

(a) 上層發(fā)酵醪

以上實驗結(jié)果說明,在酵母強化發(fā)酵的草莓發(fā)酵醪中,酵母菌是發(fā)酵體系中的優(yōu)勢菌,而細菌和霉菌在多方面競爭力較弱。在發(fā)酵醪中添加60 mg/L SO2,對相對好氧的(發(fā)酵醪上層)細菌有抑制作用,而對酵母菌和相對厭氧的(發(fā)酵醪下層)細菌抑制作用不明顯；添加120 mg/L SO2對細菌的抑制作用明顯,而對酵母菌生長無抵制作用。

2.2 酵母強化的草莓發(fā)酵醪的還原糖質(zhì)量濃度與可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的變化

可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的變化可反映發(fā)酵程度。由圖4、5可知,在不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪中,可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)均呈下降趨勢。添加0～120 mg/L SO2的發(fā)酵醪中還原糖質(zhì)量濃度先升高后減少,因為加入的蔗糖在酸性環(huán)境下水解,導(dǎo)致還原糖質(zhì)量濃度升高,而后酵母菌利用了大量糖進行發(fā)酵使還原糖質(zhì)量濃度急劇下降。添加60 mg/L SO2的發(fā)酵醪可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)下降速度最快,發(fā)酵初期還原糖質(zhì)量濃度上升幅度小,與其他SO2添加量相比,此時酵母菌數(shù)量較多,較多利用了還原糖。添加180和240 mg/L SO2時,酵母菌和細菌數(shù)量最多,利用了大量還原糖,使還原糖質(zhì)量濃度無升高趨勢。

圖4 不同SO2添加量草莓發(fā)酵醪中還原糖質(zhì)量濃度的變化

Fig.4 Changes of reducing sugar in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

圖5 不同SO2添加量草莓發(fā)酵醪中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的變化

Fig.5 Changes of soluble solid in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

2.3 酵母強化的草莓終發(fā)酵醪的酒精體積分數(shù)

表1顯示,草莓發(fā)酵醪的酒精體積分數(shù)與SO2添加量有關(guān)。較高濃度SO2對發(fā)酵體系中雜菌有較強的抑制作用,有利于酵母菌成為優(yōu)勢菌并進行酒精發(fā)酵。但SO2質(zhì)量濃度高于120 mg/L 時,因為酵母菌利用發(fā)酵醪中的營養(yǎng)物質(zhì)進行大量繁殖,對酒精發(fā)酵有一定的抑制作用,使草莓發(fā)酵醪的酒精體積分數(shù)較低。

表1 不同SO2添加量的草莓終發(fā)酵醪中的酒精體積分數(shù)

Tab.1 Ethanol content in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

ρ(SO2)/(mg·L-1)φ(酒精)/%ρ(SO2)/(mg·L-1)φ(酒精)/%04.31801.7604.82401.71205.1

2.4 酵母強化的草莓發(fā)酵醪的pH與滴定酸質(zhì)量濃度的變化

如圖6、7所示,在發(fā)酵過程中,不同SO2添加量的發(fā)酵醪pH的變化規(guī)律相似,變化幅度均較小。隨著SO2添加量增大,發(fā)酵醪pH減小,但添加0～60 mg/L SO2對發(fā)酵醪pH的影響無顯著差別。發(fā)酵前2天,不同SO2添加量的發(fā)酵醪中滴定酸質(zhì)量濃度升高,發(fā)酵中期,只有添加120 mg/L SO2的發(fā)酵醪中滴定酸質(zhì)量濃度又有升高。與其他SO2添加量的測定結(jié)果比,添加180和240 mg/L SO2的發(fā)酵醪pH較低,但滴定酸質(zhì)量濃度也較低,其原因有待于進一步探討。

圖6 不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪的pH變化

Fig.6 pH changes of strawberry fermentation mash with various SO2concentration

圖7 不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪中滴定酸質(zhì)量濃度的變化

Fig.7 Changes of titratable acid in strawberry fermentation mash with various SO2concentration

2.5 酵母強化的草莓發(fā)酵醪的游離SO2與總SO2質(zhì)量濃度的變化

由圖8、9可知,在草莓發(fā)酵過程中,發(fā)酵醪的總SO2質(zhì)量濃度始終呈下降趨勢；游離SO2質(zhì)量濃度在發(fā)酵的前24 h迅速下降,之后趨于穩(wěn)定,但添加180和240 mg/L SO2的發(fā)酵醪游離SO2質(zhì)量濃度較高。在酵母菌快速生長期間,會向胞外分泌乙醛,厭氧和低pH有利于酵母菌生成乙醛[7,14],乙醛等羰基化合物能與活性SO2結(jié)合形成復(fù)合物使游離SO2減少；pH也會影響SO2的電離平衡,pH越低,游離SO2質(zhì)量濃度越大[15]。綜合作用的結(jié)果導(dǎo)致總SO2和游離SO2的質(zhì)量濃度變化。

圖8 不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪中游離SO2質(zhì)量濃度變化

Fig.8 Changes of free-SO2in strawberry fermentation mash added various SO2concentration

圖9 不同SO2添加量的草莓發(fā)酵醪中總SO2質(zhì)量濃度變化

Fig.9 Changes of total-SO2in strawberry fermentation mash added various SO2concentration

3 結(jié) 論

草莓發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物種群變化及生化反應(yīng)過程,微生物在發(fā)酵過程中相互協(xié)作、相互制約。添加SO2影響發(fā)酵體系中微生物種群的動態(tài)變化,進一步引起草莓發(fā)酵過程的理化指標改變。添加60 mg/L SO2僅對相對好氧的細菌有抑制作用,添加120 mg/L SO2對細菌的抑制作用明顯,添加180和240 mg/L SO2時草莓酒精發(fā)酵水平較低。在發(fā)酵過程中,添加0～120 mg/L SO2的發(fā)酵醪中還原糖質(zhì)量濃度先升高后減少,添加180和240 mg/L SO2時發(fā)酵醪中還原糖質(zhì)量濃度無變化,不同SO2添加量的發(fā)酵醪中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)均呈下降趨勢,滴定酸質(zhì)量濃度和pH變化幅度均較小。

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