田 莉 莉, 王 際 輝, 葉 淑 紅, 王 晗

( 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

近年來,大腸癌的發(fā)病率不斷提高[1],該病在印度、南美、非洲等欠發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率明顯較低,這可能與飲食習(xí)慣有關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查表明,低脂肪、低蛋白、高膳食纖維飲食可以降低大腸癌的發(fā)病率。

植物甾醇是一種存在于植物中的天然活性物質(zhì),具有抗腫瘤、抗病毒、防治前列腺疾病、消炎退熱[2]的等多種生理功能。但是由于植物甾醇水溶性和脂溶性都很差,大大限制了其生理功能的發(fā)揮。因此對(duì)植物甾醇進(jìn)行改性,提高其水溶性和脂溶性,進(jìn)而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍和提高其生理功能一直是重要研究方向之一。共軛亞油酸是由亞油酸衍生的共軛雙烯酸的多種位置和幾何異構(gòu)體的總稱,具有防癌[3]、減肥[4]、增強(qiáng)免疫[5]等生理功能。但共軛亞油酸由于雙鍵的存在,極易氧化,生理功能也因此受限。植物甾醇-共軛亞油酸酯(PCLA)與植物甾醇相比,其利用吸收率提高了約5倍；與共軛亞油酸相比,抗氧化性有所提高,應(yīng)用范圍和前景更加廣泛,是一種新型藥物。目前對(duì)植物甾醇酯抗腫瘤生物活性還未見文獻(xiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)就植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用和可能的作用機(jī)制作了初步探討。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原 料

植物甾醇-共軛亞油酸酯由大連工業(yè)大學(xué)提供,共軛亞油酸由大連醫(yī)諾生物技術(shù)有限公司提供。用50%的DMSO溶解配制成200 mmol/L的儲(chǔ)藏液,分裝后置于-20 ℃?zhèn)溆?；結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29由大連醫(yī)科大學(xué)提供；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS),Hyclone 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)干粉,Sigma公司；TECAN SUNRISE酶標(biāo)儀,Tecan Austia GmbH；MCO-17A CO2恒溫培養(yǎng)箱,日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；AE30/31倒置熒光顯微鏡,廈門Motic公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29置于含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 生長曲線測(cè)定

常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞48 h,消化,用含10%的小牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)cell/well,接種于24孔板,每孔500 μL,每天每組3個(gè)重復(fù)孔,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d,每隔12 h吸去3個(gè)孔的培養(yǎng)液,消化、離心、重懸細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)孔計(jì)數(shù)2次,得出細(xì)胞濃度的平均值,繪制生長曲線。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長期的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,加入含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)液,吹打混勻后計(jì)數(shù),離心,棄舊培養(yǎng)液,加入新的培養(yǎng)液,制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,常規(guī)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,每孔100 μL,培養(yǎng)6 h,使細(xì)胞同步化。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(終濃度分別為50、100、150、200、250 μmol/L) 和空白組(直接加等體積的無血清且與實(shí)驗(yàn)組含有等量DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液),以上各組均設(shè)9個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)20、44、68 h,每個(gè)時(shí)間吸棄3個(gè)復(fù)孔中的液體,每孔加入0.5 mg/mL的MTT培養(yǎng)液(20 μL 0.5 mg/mL MTT,溶于80 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液)100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用PBS 清洗細(xì)胞表面1次,每孔加入150 μL DMSO,室溫振蕩混勻10 min,使結(jié)晶紫完全溶解,用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞570 nm處的吸光值,以空白組為對(duì)照組,其細(xì)胞活力為100%。其余各組計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞在不同濃度植物甾醇-共軛亞油酸酯培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)HT-29增殖的影響

用100～300 μmol/L植物甾醇-共軛亞油酸酯分別處理HT-29細(xì)胞24、48、72 h后,用MTT法研究細(xì)胞活力。結(jié)果由表1和圖1可見,HT-29細(xì)胞活力與藥物濃度及藥物作用時(shí)間有很大關(guān)系。與對(duì)照組相比,植物甾醇-共軛亞油酸酯的濃度達(dá)到100 μmol/L對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.01),用100～300 μmol/L 植物甾醇-共軛亞油酸酯處理24 h后,細(xì)胞的存活率呈劑量依賴性下降趨勢(shì)(P<0.05)；用植物甾醇-共軛亞油酸酯處理48或72 h后,細(xì)胞的存活率亦顯著呈劑量依賴性下降趨勢(shì)(P<0.05),在72 h植物甾醇-共軛亞油酸酯濃度為300 μmol/L時(shí),細(xì)胞增殖抑制率達(dá)93.98%。

表1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響

圖1 植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)HT-29細(xì)胞活力的影響

Fig.1 Effect of PCLA on cell viability in HT-29 cells

2.2 植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度植物甾醇-共軛亞油酸酯作用HT-29細(xì)胞24 h,倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。圖2中空白對(duì)照組HT-29細(xì)胞邊緣清晰、胞質(zhì)均勻,呈良好的貼壁生長狀態(tài)。當(dāng)植物甾醇-共軛亞油酸酯物質(zhì)的量濃度為100 μmol/L時(shí),HT-29細(xì)胞狀態(tài)開始改變,隨著劑量的增加,細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差,胞質(zhì)混濁,體積縮小,折光性變差,圓形懸浮、脫落而死亡的細(xì)胞數(shù)量逐漸增大。從圖2可以看出,植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)HT-29細(xì)胞生長有明顯地抑制作用,作用效果隨濃度的增加而增強(qiáng)。

圖2 植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響(×200倍)

Fig.2 Effect of PCLA on morphocytology

3 結(jié) 論

采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,植物甾醇-共軛亞油酸酯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 的生長和增殖有抑制作用,且以劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)依賴的方式抑制增殖,使細(xì)胞增殖減緩,數(shù)目減少,體積變小。目前關(guān)于甾醇酯類抗腫瘤作用機(jī)制方面的研究還不夠系統(tǒng)和深入,多數(shù)研究仍停留在藥效觀察水平,有待于進(jìn)一步研究。

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