常 藝 海, 叢 麗 娜, 盧 冬

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

溶菌酶通過切斷細(xì)菌細(xì)胞壁中黏多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵的聯(lián)結(jié),解體肽聚糖支架,導(dǎo)致細(xì)胞裂解, 從而起到殺死細(xì)菌的作用[1]。溶菌酶分布廣泛,主要存在于動物、植物和微生物的各種組織、體液及分泌物中[2],同時也是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一[3]。已有文獻(xiàn)報道水生動物重組溶菌酶抗菌譜與雞蛋溶菌酶在功能上存在明顯的差異,它不僅能溶解常見的革蘭氏陽性菌,而且還能溶解革蘭陰性菌,通常引起水產(chǎn)動物嚴(yán)重病害的病原菌主要是以副溶血性弧菌為主的革蘭陰性菌[4]。因此,重組海參溶菌酶可以應(yīng)用于水生動物的病害防治及提高其自身機體自身免疫能力等方面。作者以海參i-型溶菌酶cDNA的成熟肽基因為模板,設(shè)計一對特異性引物并擴(kuò)增出目的基因SL,將其連接到表達(dá)載體pET32a(+)上,從而構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET-32a(+)-SL,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá),最后對表達(dá)后的海參溶菌酶進(jìn)行Western blotting鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS和表達(dá)載體pET-32a(+),Novagen(美國)公司；大腸桿菌DH5α和克隆載體pMD18-T,TaKaRa Biotechnology(大連)公司。

1.1.2 試劑與工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶、DNA ladder marker、蛋白低分子質(zhì)量marker、TaKaRa one step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒、RNAiso Plus試劑,TaKaRa Biotechnology(大連)公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司； HisTrap HP,GE Healthcare(美國)公司；Penta-His抗體,Qiagen(德國)公司；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG單抗,Zymed(美國)公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 海參溶菌酶(SL)成熟肽基因的擴(kuò)增

(1)RNA模板制備:取新鮮海刺參腸,在含有液氮的研缽中攪碎,根據(jù)RNAiso Plus試劑說明抽提總RNA。提取后的樣品放在-80 ℃保存。

(2)海參SL基因的PCR擴(kuò)增:以海參溶菌酶cDNA序列為模板,設(shè)計上游引物HS-Q-1和下游引物HS-Q-2,并分別引NcoⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點(下劃線表示)。

HS-Q-1:5′-GGCCATGGCTATGCAAGTT

CCTTCTGAT-3′

HS-Q-2:5′-GTCGAGGAATTCTCAGTTG

TTGCTCATGTC-3′

使用TaKaRa one step RNA PCR Kit(AMV)進(jìn)行RT-PCR。50 μL反應(yīng)體系:RNase Free dH2O 24 μL,10×One Step RNA PCR Buffer 5 μL,MgCl2(25 mmol/L)10 μL,dNTP Mixtrue(各10 mmol/L)5 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL,AMV RNase XL (5 U/μL)1 μL,Total RNA(1 μg/μL)1 μL,AMV-Optimized Taq(5 U/μL)1 μL,上游特異性引物(20 μmol/L)1 μL,下游特異性引物(20 μmol/L)1 μL。PCR循環(huán)參數(shù):50 ℃ 30 min,94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,61 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取出PCR產(chǎn)物5 μL,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因是否正確。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-SL的構(gòu)建

利用瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒將正確的目的基因SL片段回收并純化。將其在16 ℃ 條件下,過夜連接至克隆載體pMD18-T上,構(gòu)建pMD18-SL重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行氨芐西林和藍(lán)白斑篩選。選擇菌落PCR和雙酶切質(zhì)粒鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pMD18-SL,測序驗證其序列的正確性。用NcoⅠ和EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒pMD18-SL后,回收目的基因片段SL,并于16 ℃過夜連接至經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶處理pET32a(+)載體上,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-SL。將pET32a(+)-SL和pET 32 a(+)同時轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞中,并在含有100 μg/mL氨芐西林和34 μg/mL的氯霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃ 過夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落接種于100 μg/mL 氨芐西林和34 μg/mL 氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)10～12 h,按照質(zhì)粒提取試劑盒的說明提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR及雙酶切檢測鑒定。選擇菌落PCR和雙酶切鑒定都為陽性的重組質(zhì)粒pET32a(+)-SL,測序驗證其序列是否正確。

1.2.3 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測序驗證正確的重組質(zhì)粒pET32a(+)-SL和陰性對照空載體轉(zhuǎn)化的陽性菌株,分別接種于含100 μg/mL氨芐西林、34 μg/mL氯霉素及終質(zhì)量濃度為10 g/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,160 r/min過夜培養(yǎng)。按1%的接種量接種于含100 μg/mL氨芐西林、34 μg/mL氯霉素和質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,160 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.7,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.5 mmol/L),28 ℃,120 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h左右。按參照文獻(xiàn)[5]的方法,離心收集誘導(dǎo)后的菌體,重懸于已預(yù)冷的1×PBS (pH 7.4)緩沖液中,再加入Triton X-100 至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。置冰浴中超聲裂解至不再黏稠。將超聲裂解后的液體懸液4 ℃,12 000 r/min離心15 min,收集上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆?。最后將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、上清液和沉淀4個樣品,采用15%分離膠濃度的SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)。濃縮膠及分離膠的配置參照文獻(xiàn)[6]。

參照GE Healthcare 的HisTrap HP使用說明,準(zhǔn)備1 mL HisTrap HP affinity column(即Ni2+-NTA親和層析柱),用約10倍柱體積蒸餾水沖洗柱子,用約10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(40 mmol/L 咪唑、20 mmol/L磷酸鈉溶液、500 mmol/L NaCl,pH 7.4)平衡。破碎離心后的上清液樣品經(jīng)0.22 μm過濾處理后,以約1.0 mL/min 上柱,再用約24倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗柱子,最后用約10倍柱體積的洗脫液(500 mmol/L咪唑、20 mmol/L磷酸鈉溶液、500 mmol/L NaCl,pH 7.4),洗脫目的蛋白SL,收集并取適量的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 Western blotting 檢測重組蛋白SL

將提取的總蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,放置在含1.5% BSA封閉緩沖液中,4 ℃平放過夜。加入1∶1 000稀釋的Penta-His抗體,進(jìn)行一次抗體反應(yīng)1 h。Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)含0.1% Tween 20,洗滌2次；洗滌Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)沖洗3次后,再加1∶1 000的稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG單抗,進(jìn)行二次抗體反應(yīng)1 h。再重復(fù)洗膜1次,再加入TrueBlue過氧化物酶底物,顯色1 min后,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SL成熟肽基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用海刺參溶菌酶的cDNA 序列為模板,設(shè)計上游引物HS-Q-1和下游HS-Q-2,其中在引物HS-Q-1的5′端引入NcoⅠ和HS-Q-2的3′端引入EcoRⅠ限制性酶切位點,經(jīng)RT-PCR 得到了長度約400 bp(圖1)的特異性PCR產(chǎn)物,與理論大小基本一致。將提取后pMD18-SL質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切,并割膠回收目的基因SL,將其連接到經(jīng)過同樣處理的pET-32a(+) 載體上,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α。經(jīng)菌落PCR檢測,在400 bp左右顯示一條特異性亮帶,再提取該菌的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,結(jié)果顯示出(圖2)與預(yù)計的目的片段和空白載體大小一致的條帶,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將該質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證,結(jié)果顯示其與GenBank中海刺參cDNA的成熟肽完全一致。

M, 100 bp DNA ladder marker; 1, amplification of SL

M1, 1 000 bp DNA ladder marker; 1, pET32a(+)-SL;2, digested product by NcoⅠand EcoRⅠ;M2, 100 bp DNA ladder marker; 3, colony PCR product

圖2 重組質(zhì)粒pET32a(+)-SL酶切及菌落PCR鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET32a(+)-SL

2.2 重組SL蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-SL,轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)pLysS中,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)15% SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3)顯示,誘導(dǎo)后的樣品比誘導(dǎo)前樣品在約31 ku明顯多出1條特異性條帶,經(jīng)過生物學(xué)軟件分析,SL基因編碼125個氨基酸,分子質(zhì)量為14.14 ku,此外,載體上融合表達(dá)的His-Tag標(biāo)簽等序列的分子質(zhì)量為17.42 ku左右,因此重組蛋白SL的分子質(zhì)量應(yīng)為31.56 ku,與實際值基本一致。經(jīng)Bandscan 5.0的分析,重組蛋白SL表達(dá)量約占總菌體蛋白的48%,這說明海參溶菌酶SL在大腸桿菌中能夠高效表達(dá)。再將該誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液離心收集菌體,用超聲破碎細(xì)胞,破碎后的上清液和沉淀分別經(jīng)SDS-PAGE檢測,經(jīng)分析SL在上清液中約占重組蛋白總量的10%,表明重組SL蛋白以部分可溶性蛋白的形式表達(dá)(圖3)。

2.3 重組SL蛋白的Western blotting分析

經(jīng)過Western blotting鑒定后發(fā)現(xiàn),重組SL蛋白在31 ku左右可以與Penta-His Antibody發(fā)生特異性的結(jié)合(圖4),證明該重組SL在大腸桿菌中得到正確表達(dá)。

M, standard protein; 1, the non-induced strain;2, the same strain induced by IPTG for 15 h;3, the supernatant of the strain by ultrasonication;4, the precipitation of the strain by ultrasonication;5, purified SL by Ni2+-NTA affinity chromatography

圖3 重組SL的表達(dá)與純化的SDS-PAGE檢測

Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET-32a(+)-SL/E.coliRosetta(DE3)pLysS

M, precision plus protein marker;1, the non-induced strain;2, the same strain induced by IPTG for 15 h;3, the non-induced strain detected by Western blotting;4, the same strain induced by IPTG for 15 h detected by Western blotting

圖4 重組SL的Western blotting分析

Fig.4 The Western blotting analysis of the recombinant SL

3 討 論

溶菌酶作為非特異性生物防御因子能對某些細(xì)菌發(fā)揮先天抵抗作用,可誘導(dǎo)其他免疫因子的合成和分泌[7]。溶菌酶這類先天性免疫中重要的生物防御效應(yīng)器,在水產(chǎn)動物抵抗病原微生物感染中具有重要作用。因此,利用基因工程菌的方法生產(chǎn)溶菌酶可以有效地緩解病原微生物對水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害。

本研究通過設(shè)計海參i-型溶菌酶的成熟肽基因SL,構(gòu)建了基因工程菌pET32a(+)-SL/E.coliRosetta(DE3)pLysS。重組蛋白SL主要以包涵體的形式存在,只有約10%的可溶性蛋白。研究證明,蛋白質(zhì)的可溶性與溫度有關(guān),適當(dāng)?shù)牡蜏赜欣诘鞍踪|(zhì)的正確折疊,從而生成可溶性蛋白[8]。唐金寶等[9]在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)至1%的Triton X-100及1%甘氨酸,可使ProZZ-EGFP基因在培養(yǎng)液中的可溶性表達(dá)量提高6倍。因此,可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)溫度、時間以及通氧量等因素來增加重組蛋白的可溶性。

通過優(yōu)化該工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件,將有望實現(xiàn)海參溶菌酶的可溶性高效表達(dá),可為對海參溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)的分析奠定基礎(chǔ)。

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