周金敏 周 櫻

(武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢 430074)

水產(chǎn)配合飼料中使用的植物性原料常存在一些非淀粉多糖、果膠等物質(zhì)，這些物質(zhì)會影響水產(chǎn)動物對有效營養(yǎng)成分的消化和吸收。復(fù)合酶制劑能使這些物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)，降低消化道的黏度，有效消除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的不良影響，從而改善水產(chǎn)動物的消化機(jī)能。此外，水產(chǎn)動物飼料中蛋白質(zhì)含量較高，復(fù)合酶制劑中的蛋白酶能夠補(bǔ)充水產(chǎn)動物內(nèi)源性蛋白酶的不足，提高蛋白質(zhì)的利用率。本研究選擇草魚為研究對象，在已有研究的基礎(chǔ)上研究直接加酶和降低蛋白后加酶對草魚生長和消化酶活性的影響，為復(fù)合酶在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)草魚[(40.70±0.52)g]購自仙桃某漁場，為當(dāng)年同一批苗種。試驗(yàn)前將草魚集中暫養(yǎng)，用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)3周，使之逐漸適應(yīng)試驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共分6個組，E1組和E2組為對照組，分別飼喂蛋白水平約為30%和28.5%的基礎(chǔ)日糧；E11、E13組在E1組基礎(chǔ)上分別添加100 g/t、300 g/t的酶；E21、E23組在E2組基礎(chǔ)上分別添加100 g/t、300 g/t的酶。每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾魚。

1.3 試驗(yàn)飼料

以豆粕、菜粕、棉粕、面粉和麩皮為原料配制飼料。復(fù)合酶X由武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司根據(jù)水產(chǎn)飼料組成特點(diǎn)設(shè)計(jì)生產(chǎn)，主要包括蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶等。原料粉碎過60目篩，按配方準(zhǔn)確稱量各種飼料原料，微量組分采用逐級擴(kuò)大法混合，先將固體原料及復(fù)合酶X混合均勻，后加脂肪和10%左右的水，再次混合均勻，用小型環(huán)模顆粒機(jī)壓制成粒徑為2.0 mm的顆粒飼料，晾干后用封口袋包裝備用。E1組和E2組的日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（%）

1.4 試驗(yàn)過程

試驗(yàn)在水族箱中進(jìn)行。挑選體格健壯、規(guī)格一致的草魚450尾隨機(jī)分成6組，每組3個重復(fù)。試驗(yàn)開始前，將試驗(yàn)魚饑餓12 h，每缸稱重。試驗(yàn)期間每天分兩次（9：00和 16：00）飽食投喂，投喂率約為體重的3%，水溫為26℃左右。投喂60 d后饑餓12 h，對各組試驗(yàn)魚進(jìn)行稱重并計(jì)數(shù)，每箱取4尾草魚用于測定蛋白酶和淀粉酶活性。

1.5 樣品分析測定方法

1.5.1 測定指標(biāo)

根據(jù)試驗(yàn)始末試驗(yàn)魚的重量和采食量計(jì)算增重率、特定生長率和餌料系數(shù)。

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100；

特定生長率（SGR，%/d）=[（LnWt-LnW0）]/t×100；

餌料系數(shù)（FCR）=R/（Wt+G-W0）。

其中：W0、Wt分別為魚體初始重和終重（g）；t為試驗(yàn)天數(shù)（d）；R為投餌量(g)；G為死亡個體重（g）。

1.5.2 消化酶樣品制備

試驗(yàn)魚饑餓12 h后，每個重復(fù)隨機(jī)抽取4尾，于冰盤中迅速解剖，取出腸道，剔除脂肪和結(jié)締組織，等分前、后腸，用冷凍去離子水洗凈腸道中的內(nèi)容物，濾紙吸干水分，剪碎，稱重。按1：10（w/v）加入4℃的雙蒸水，在組織勻漿器中勻漿（4℃），然后冷凍離心機(jī)6 000 r/min離心10 min，取出上清液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?4 h內(nèi)分析完畢。

1.5.3 蛋白酶活性

參照文獻(xiàn)的方法，以2.0%干酪素(0.02 M、pH值8.0左右的磷酸鹽緩沖液配制)作底物,取1 ml于30℃水浴預(yù)熱5 min，加入1.0 ml酶粗提液（對照組先加三氯乙酸使酶失活，再加底物），反應(yīng)10 min，然后加10%三氯乙酸2 ml，終止反應(yīng)，過濾，取上清液0.5 ml加0.55 M Na2CO32.5 ml，再加0.5 ml福林酚試劑，于30℃水浴中顯色20 min，最后在680 nm波長下比色，以對照組調(diào)零，測吸光度。用同樣的方法求出標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸-吸光度的回歸方程，運(yùn)用回歸方程計(jì)算經(jīng)酶分解干酪素所產(chǎn)生的酪氨酸的量（μg）。蛋白酶活性單位：1 g食糜或組織在30℃、pH值8.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個蛋白酶活性單位（U/g）。

1.5.4 淀粉酶活性

淀粉酶活性采用淀粉酶試劑盒（由南京建成生物工程研究所研制）測定。取底物緩沖液1 ml于30℃預(yù)熱5 min，在測定管中加入酶液20 μl混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)7.5 min，再加入碘應(yīng)用液1 ml終止反應(yīng)并顯色，隨后加蒸餾水6.0 ml（空白管加6.02 ml），混勻，用蒸餾水調(diào)零測定660 nm波長下的吸光度。淀粉酶活性單位：1 g食糜或組織在30℃、pH值7.0的條件下，每分鐘水解l mg的淀粉為一個淀粉酶活性單位(U/g)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)差異顯著時，用Duncan's檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為0.05。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶對草魚生長性能的影響(見表2)

表2 不同蛋白水平下復(fù)合酶對草魚生長性能的影響

由表2可知，與E1組相比，直接加酶的E11、E13組的增重率分別提高了3.97%、9.69%；特定生長率分別提高了2.44%、6.50%；餌料系數(shù)分別降低了3.21%、10.16%；其中，300 g/t的添加組（E13）優(yōu)于 100 g/t添加組(E11)，E13組的餌料系數(shù)顯著低于E1組(P＜0.05)。降低1.5個百分點(diǎn)蛋白（E2組）后，草魚的增重率和特定生長率顯著降低；在此基礎(chǔ)上添加酶制劑（E21、E23組），草魚的生長性能變化與E1、E11、E13組的趨勢相同，且E23組的增重率、特定生長率和餌料系數(shù)均顯著優(yōu)于E2組（P＜0.05）；同時，E21組和 E23組與E1組相比無顯著性差異。結(jié)果表明，在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草魚幼魚飼料中直接添加100～300 g/t復(fù)合酶均有改善草魚生長性能的作用，且添加量的增加對草魚的生長有促進(jìn)作用。飼料蛋白含量的降低會影響草魚的生長性能，但添加該復(fù)合酶后有明顯的改善，與原蛋白水平下的生長性能無顯著差異。

2.2 復(fù)合酶對草魚腸道消化酶活性的影響(見表3)

表3 不同蛋白水平下復(fù)合酶對草魚腸道消化酶活性的影響（U/g）

由表3可見，在E1組基礎(chǔ)上直接加酶（E11、E13組），草魚的腸道蛋白酶活性和淀粉酶活性均有所增加；其中，300 g/t的添加組（E13）高于 100 g/t添加組（E11），E11組的蛋白酶活性及E13組的蛋白酶活性和前腸淀粉酶活性與E1組相比差異顯著(P＜0.05)。降低蛋白（E2組）后加酶（E21、E23組），草魚的消化酶活性變化與E1、E11、E13組的趨勢相同，且E21組的蛋白酶活性及E23組的蛋白酶活性和淀粉酶活性與E2組相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草魚幼魚飼料中直接添加100～300 g/t復(fù)合酶均能大幅度提高草魚腸道消化酶的活性，且與酶的添加量正相關(guān)。

3 討論

植物細(xì)胞壁是由多種聚化物（纖維素、半纖維素和果膠等）通過氫鍵或共價鍵相互交聯(lián)組成的，難以被單胃動物和無胃動物利用。水產(chǎn)飼料一般主要由餅粕類和谷類籽實(shí)等植物性原料及其副產(chǎn)物組成，其中細(xì)胞壁的存在降低了養(yǎng)分的消化和吸收率。在水產(chǎn)飼料中添加外源酶制劑（如纖維素分解酶類）能全面促進(jìn)飼料中營養(yǎng)成分的消化分解，降低日糧中的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，補(bǔ)充內(nèi)源性酶的不足，提高動物對營養(yǎng)成分的消化吸收，提高飼料效率，進(jìn)而提高魚體的生產(chǎn)性能。周小秋(2001)在含豆粕、菜粕、棉仁粕為主的飼料中添加酶制劑，提高了飼料利用率，降低了鯉魚消化道的黏性，有利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收，對鯉魚的增重、餌料系數(shù)有顯著的影響。張璐等（2009）用非淀粉多糖酶飼喂（1.88±0.01）g大黃魚，極顯著提高了大黃魚的特定生長率(P＜0.01)。Lin等(2007)在羅非魚的研究中表明，隨復(fù)合酶制劑（中性蛋白酶4 500 U/g、β-葡聚糖酶800 U/g和木聚糖酶1 600 U/g）添加量的增加，試驗(yàn)羅非魚的特定生長率和飼料效率顯著增加(P＜0.05)。本試驗(yàn)復(fù)合酶主要含有蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等，在草魚的飼料中適量添加，能有效降解飼料原料中的纖維素、半纖維素、果膠等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，使之轉(zhuǎn)化為消化道能吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，并釋放提高飼料效率和有助于改善其他主要營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的物質(zhì)，起到了間接營養(yǎng)的作用。

腸道內(nèi)源消化酶活性反映了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)消化能力的大小。復(fù)合酶制劑一定范圍內(nèi)能夠補(bǔ)充魚體內(nèi)源消化酶的不足。研究顯示，外源酶的添加能增加食糜中消化分解產(chǎn)物的含量，刺激腸道化學(xué)感受器誘導(dǎo)促胰酶素（CCK）的分泌，進(jìn)而促進(jìn)消化酶的分泌。在許多魚類的腸道黏膜檢測到了類似CCK的化合物。腸道接受游離脂肪酸（FFA）和游離氨基酸（FAA）刺激時會引起這一類物質(zhì)釋放，并引發(fā)內(nèi)源酶的分泌。張麗（2008）分別在飼料中添加200 mg/kg復(fù)合酶制劑和50～100 mg/kg木聚糖酶，均促進(jìn)了異育銀鯽腸道蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的分泌，有利于其酶活性的提高（P＜0.05）。NSP酶也提高了羅非魚肝胰腺和腸道淀粉酶活性，酶活性增長分別達(dá)到11.4%和49.5%（Li，2009）。烏蘭等（2009）研究表明，在飼料中添加耐高溫酶制劑能提高奧尼羅非魚消化酶活性，當(dāng)耐高溫酶制劑添加量為0.10%時，奧尼羅非魚的前腸蛋白酶活性和淀粉酶活性以及肝胰臟淀粉酶活性最高，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。本試驗(yàn)飼料中含有較多的豆粕、菜粕、棉粕和面粉、麩皮，在其中添加復(fù)合酶均在一定程度上提高了蛋白酶和淀粉酶的活性，有助于草魚更好地消化植物飼料中的蛋白質(zhì)和碳水化合物，從而達(dá)到促進(jìn)生長的作用，與以上結(jié)論一致。

4 結(jié)論

①在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草魚幼魚飼料中直接添加100～300 g/t復(fù)合酶X均有改善草魚生長性能的作用，且添加量的增加對魚的生長有促進(jìn)作用。飼料蛋白含量的降低會影響草魚的生長性能，但添加該復(fù)合酶后有明顯的改善，與原蛋白水平下的生長性能無顯著差異。

②在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草魚幼魚飼料中直接添加100～300 g/t復(fù)合酶X均能大幅度提高草魚腸道消化酶的活性，且與酶的添加量正相關(guān)。