蘭桂萍 司勇鋒 韋海明 何寧 覃揚(yáng)達(dá) 黃波 何承誠(chéng)

鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的頭頸部鱗癌。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，但中晚期鼻咽癌因腫瘤負(fù)荷大，治療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高。rAd-p53是通過(guò)腺病毒載體將野生型p53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮治療效應(yīng)[1]，可協(xié)同放化療發(fā)揮作用。為了解rAd-p53聯(lián)合放化療治療中晚期鼻咽癌的治療效果，本文主要對(duì)治療前后的鼻咽部腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)（TUNEL法）。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本組61名病例源于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，男50例，女11例，年齡在22～63歲之間，中位年齡42歲。全部病例經(jīng)病理診斷為未分化非角化性癌，均行鼻咽顱底CT（或MRI）、B超、X線及鼻內(nèi)鏡檢查了解病變范圍；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年齡在20～65歲之間；卡氏評(píng)分≥70分；簽署知情同意書。全部病例隨機(jī)分為2組，治療組：rAd-p53瘤內(nèi)注射+同步放化療，對(duì)照組：同步放化療。兩組病例之間年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 放射治療：采用西門子Primus全數(shù)字化直線加速器常規(guī)體外照射，采用面頸聯(lián)合野照射36Gy后縮野，采用耳前野輔以鼻前野，原發(fā)灶70～76Gy/35f/7～8w，頸轉(zhuǎn)移灶60～70Gy。

化學(xué)藥物治療：卡鉑+5-Fu方案。劑量按體表面積計(jì)算，卡鉑500mg·（m2·d）-1，d1靜脈點(diǎn)滴，5-Fu 500mg·（m2·d）-1，d1-5，24小時(shí)微泵持續(xù)輸入，與放療同步進(jìn)行，21天后重復(fù)化療1次，共2個(gè)周期。

rAd-p53瘤內(nèi)注射：重組人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中國(guó)深圳賽百諾公司生產(chǎn)）劑量：1×1012VP/支，1次/周，治療6～8周；用法：用生理鹽水稀釋rAd-p53到2ml后使用，在鼻內(nèi)鏡直視下分3點(diǎn)注入鼻咽部原發(fā)灶內(nèi)；用藥時(shí)間：于放療前48～72小時(shí)行瘤內(nèi)注射。

1.2.2 鼻咽癌原發(fā)灶標(biāo)本采取及處理 分別于治療前及放療至20Gy（第3次rAd-p53瘤內(nèi)注射后）獲取活體組織標(biāo)本。用1%麻黃素液和1%的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻內(nèi)鏡直視下于鼻咽部瘤體處應(yīng)用活檢鉗獲取活體組織標(biāo)本。全部標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)羅氏公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)公司。TUNEL染色：常規(guī)脫蠟脫水，過(guò)氧化氫封閉后，微波處理230分鐘。TDT酶、biodUTP37℃孵育1h。生物素標(biāo)記-HRP37℃孵育1h。DAB顯色、樹(shù)封、脫水、封片。用已知的陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 觀察指標(biāo) 凋亡指數(shù)：細(xì)胞核染成棕褐色為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取腫瘤區(qū)域，在高倍鏡（40×10）下，計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出凋亡指數(shù)（AI）（AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%）。隨訪時(shí)間是2007年01月～2011年01月，隨訪方式是患者定期回院復(fù)查和專職隨訪員電話隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有分析均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以(±s)表示，組間采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前后的細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）的變化 對(duì)照組治療前后的AI分別為（4.455±1.670）%、（8.252±4.076）%，治療組治療前后的AI分別為（4.453±1.670）%、（13.370±6.957）%，治療組治療前后、對(duì)照組治療前后、治療組與對(duì)照組治療后AI有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。（見(jiàn)表1）。

表1 兩組患者治療前后鼻咽癌原發(fā)灶細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比情況

3 討論

目前放化療成為中晚期鼻咽癌的主要治療手段。但因中晚期鼻咽癌腫瘤較大，其中不乏大量的乏氧細(xì)胞，對(duì)放化療并不敏感，而我們將rAd-p53聯(lián)合同步放化療應(yīng)用于治療中晚期鼻咽癌患者卻獲得了較好的臨床效果[2]。

細(xì)胞凋亡是一種具有特定形態(tài)和生化改變的細(xì)胞死亡過(guò)程。p53基因的產(chǎn)物p53蛋白的主要功能是維護(hù)細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，在參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。當(dāng)細(xì)胞DNA出現(xiàn)損傷時(shí)，p53蛋白活化，可以阻滯細(xì)胞周期，修復(fù)細(xì)胞DNA；當(dāng)細(xì)胞DNA損傷無(wú)法修復(fù)的時(shí)候，p53蛋白可以上調(diào)促凋亡基因，下調(diào)抗凋亡基因，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]；p53蛋白還可以直接刺激Bax蛋白或者caspase-8，不經(jīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑直接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。放療和化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)主要依賴p53基因途徑引發(fā)的細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[4]。rAd—p53不僅具有獨(dú)立的抑制多種腫瘤生長(zhǎng)的作用，還可以通過(guò)激活bax基因、抑制bcl—x基因以及誘導(dǎo)前凋亡基因puma、bak、fas的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高多種腫瘤細(xì)胞對(duì)化、放療的敏感性[5]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組同步放化療，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高，治療前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明放化療后具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；但治療組治療前后細(xì)胞凋亡指數(shù)增高更明顯，而且治療組與對(duì)照組治療后的細(xì)胞凋亡指數(shù)比較具有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的rAd-p53基因與放化療一樣發(fā)揮了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而且與放化療具有協(xié)同治療作用。而我們的臨床研究也證實(shí)[6]，rAd-p53瘤內(nèi)注射聯(lián)合同步放化療治療中晚期鼻咽癌患者可獲得更好的腫瘤完全緩解率。Pan等[7]應(yīng)用rAd-p53聯(lián)合放療治療鼻咽癌病人的6年隨訪資料顯示rAd-p53可以更好控制鼻咽癌的發(fā)展和提高生存率?？梢?jiàn)rAd-p53瘤內(nèi)注射聯(lián)合同步放化療治療中晚期鼻咽癌可以取得更好的治療效果。

[1]張珊文.中國(guó)p53基因治療的現(xiàn)狀和前景[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37（6）：3-5.

[2]司勇鋒,何承誠(chéng),蘭桂萍.重組人p53腺病毒注射液聯(lián)合放化療對(duì)中晚期鼻咽癌消退率的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床，2009，36（18）：1031-1033.

[3]Smith ND,Rubenstein JN,Eggener SE,et al.The p53 tumor suppressor gene and nuclear protein:basic science review and relevance in the management of bladder cancer[J]. J Urol,2003,169(4):1219-1228.

[4]Dey A,Verma CS,Lane DP.Updates on p53:modulation of p53 degradation as a therapertic approch[J].Br J Cancer,2008,98(1):4-8.

[5]張躍偉，娜仁圖戈，李闖，等.內(nèi)鏡下rAd—p53注射聯(lián)合動(dòng)脈灌注治療進(jìn)展期胃癌[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2010,16(11):171-172.

[6]蘭桂萍，蘇紀(jì)平，司勇鋒，等.重組人p53腺病毒聯(lián)合放化療治療中晚期鼻咽癌的臨床觀察[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（13）：2341-2344.

[7]Pan JJ,Zhang SW,Chen CB,et al.Effect of recombinant Adenovirus-p53 Combined With Radiotherapy on Long-Time Prognosis of Advanced Nasopharyngeal Carcinoma[J].J Chin Oncol,2009,27(5)：799-804.