杜曉晉 吳素慧 尚海霞

宮頸癌是女性婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制尚不清楚，臨床多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且易復(fù)發(fā)，嚴重威脅著婦女的健康和生命。核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其激活后參與調(diào)節(jié)多種細胞因子、粘附因子的表達，在炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。MMP-9在多種惡性腫瘤中表達增高，有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在乳腺癌中參與MMP-9的轉(zhuǎn)移及侵襲[2]。目前宮頸癌中NF-κB與MMP-9關(guān)系的研究尚未多見，本研究檢測NF-κB和MMP-9在兩種宮頸癌細胞中的表達，揭示NF-κB、MMP-9在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人NF-κB多克隆抗體購自北京博奧森生物工程有限公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，NF-κB酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物公司。宮頸癌細胞株siha和caski均購自武漢博士德生物工程有限公司。在37℃條件下，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)液MEM、RPMI-1640均含10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素（各1U/ml），實驗細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2 免疫細胞化學(xué)檢測NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞中的表達 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，將細胞密度為1×105的細胞懸液接種于裝有蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，制備細胞爬片，細胞爬片用PBS洗5min×3次，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗3min×3次，采用SP法檢測NF-κB、MMP-9的蛋白表達，一抗?jié)舛染鶠?:50。采用NF-κBp65蛋白染色以細胞質(zhì)和(或)細胞核呈棕黃色為陽性表達，MMP-9陽性細胞均表現(xiàn)為細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)含棕黃色顆粒，根據(jù)染色強度測定平均灰度值進行分析。

1.3 ELISA法檢測NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞上清液中的表達 實驗步驟嚴格按試劑盒說明中的操作步驟進行，用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值（OD），根據(jù)樣品的OD值在坐標(biāo)上找出相對應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，計量資料兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細胞中NF-κB、MMP-9蛋白的表達（見表1） 免疫細胞化學(xué)方法結(jié)果表明，NF-κB在宮頸癌細胞中主要表達于細胞質(zhì)和/或細胞核，與siha細胞相比，在轉(zhuǎn)移性的宮頸癌caski細胞中表達較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意（P＜0.01）。MMP-9在癌細胞中主要表達于細胞質(zhì)或細胞膜，且在caski細胞中表達較siha細胞高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞中的表達（±s）

表1 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞中的表達（±s）

細胞因子 siha細胞 caski細胞 P值NF-κB 141.35±5.27 110.62±3.79 0.000 MMP-9 139.85±3.41 108.29±6.52 0.000

2.2 宮頸癌細胞上清液中NF-κB、MMP-9蛋白表達（見表2） ELISA法結(jié)果顯示，NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞中均有表達，與siha細胞比較，在轉(zhuǎn)移的caski細胞中表達較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示宮頸癌細胞可以分泌NF-κB、MMP-9，且在轉(zhuǎn)移的細胞中分泌增加。

表2 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞上清液中的表達（±s）

表2 NF-κB、MMP-9在兩種宮頸癌細胞上清液中的表達（±s）

細胞因子 siha細胞 caski細胞 P值NF-κB 62.47±3.69 93.14±3.26 0.000 MMP-9 67.58±4.52 96.85±4.72 0.000

3 討論

NF-κB是一種多功能細胞核轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)典形式是由p50/p65組成的異源二聚體，在正常情況下，與其抑制物I-κB蛋白結(jié)合，以無活性形式存在于細胞質(zhì)中。當(dāng)細胞中NF-κB受到外界刺激后被激活，活化的p50/p65進入到細胞核中，啟動或調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達及轉(zhuǎn)錄，如Cyclin D1,Bcl-2,MMP-9等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中有NF-κB的異常表達及激活，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。并認為NF-κB可能通過調(diào)控細胞生長增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達,促進惡性腫瘤的發(fā)展[6]。田衛(wèi)紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的亞單位p50和p65在宮頸癌細胞系中存在表達，并證實激活的p50、p65具有與DNA結(jié)合并促進轉(zhuǎn)錄的能力且存在mRNA的表達。這與我們的研究是一致的，本實驗中，通過免疫細胞化學(xué)和ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)，NF-κB在不同宮頸癌細胞株中均有陽性表達，主要表達在細胞質(zhì)和細胞核，表明宮頸癌細胞中不僅有NF-κB的表達而且存在激活，其在轉(zhuǎn)移的caski細胞中表達較siha細胞高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示NF-κB在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

MMP-9是人類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員中重要的酶系，參與Ⅰ型及Ⅳ型膠原和細胞外基質(zhì)（ECM）的降解，人類MMP-9啟動子含有順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括NF-κB（-600bp）和AP-1(-533bp,-79bp)的結(jié)合位點，這些因子參與MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，Yoonseo Kim[2]等利用南蛇藤素抑制NF-κB的活性，進而抑制MMP-9基因的表達，從而降低人類乳腺癌細胞MCF-7的轉(zhuǎn)移及侵襲。本實驗中,通過免疫細胞化學(xué)法和ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白在不同宮頸癌細胞株中呈現(xiàn)陽性表達，與siha細胞比較，在轉(zhuǎn)移的caski細胞中表達較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示MMP-9在促進宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用，表明NF-κB信號通路的激活與其下游調(diào)控基因MMP-9的表達有著密切的關(guān)系，二者協(xié)同作用共同促進宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移。

總之，NF-κB在不同的宮頸癌細胞中不僅有表達且存在激活，活化的NF-κB可調(diào)控其下游靶基因MMP-9的表達，進而促進腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。由于NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及促進浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,因此阻斷NF-κB和MMP-9可作為基因治療的的靶點。

[1]Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B:the enemy with in [J].Cancer Cell, 2004,6(3):203-208.

[2]Yoonseo Kim.Celastrol inhibits Breast Cancer Cell Invasion via Suppression of NF-κB-mediated MatrixMetalloproteinase-9 Expression. Cell Physiol Biochem，2011,28:175-184。

[3]Dolcet X,Llobet D,Pallares J,et al.NF-kB in development and progression of human cancer[J].VirchowsArch,2005,446(5):475-475.

[4]Qiao L, Yu J,Dent P,et al.NF-kappa B protects ratARL-6 hepato cellular carcinoma cells against hydrogen peroxide induced apoptosis[J].Cancer Biol Ther,2005,4(11):1195-1195.

[5]Sovak MA,Bellas RE,Kim DW.Aberrant nuclear factor -κB/R el expression and the pathogenesis of breast cancer[J].J Clin Invest,1997,100(12):2952-2960.

[6]Suh J,Rabson AB.NF-kappa B activation in human prostate cancer:important mediator or epiphenomenon[J].Cell Biochem,2004,91(1):100-117.

[7]田衛(wèi)紅,田芳,許培榮,等.HeLa細胞系中核轉(zhuǎn)錄因子-κB與Bcl-2的表達[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009,44(1):74-77.