陳志琴 陳海燕 林美姜 劉佳華

浸潤(rùn)性宮頸癌(invasive carcinoma of cervix，ICC)為常見婦科惡性腫瘤[1]。世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率在女性腫瘤中排第2位，呈升高和低齡化趨勢(shì)。宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是與ICC密切相關(guān)的一組癌前病變，早期診斷和治療CIN可降低宮頸癌的發(fā)病率及病死率，對(duì)提高患者的生活質(zhì)量有著極其重要的意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGFR-3結(jié)合，介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化增殖、分化和淋巴管的增生，是迄今公認(rèn)的淋巴管生成因子。本研究采用免疫組化方法測(cè)定VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC病例中表達(dá)情況，探討VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC中的表達(dá)變化情況，闡明宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴血管形成的表型可能發(fā)生的時(shí)期。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年9月～2011年7月福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科門診及住院患者為研究對(duì)象。年齡21～63歲，中位年齡36歲。分為4組：CIN I組，共33例；CINⅡ組，共32例；CIN III組，共37例；ICC組，共30例，其中9例盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。各組術(shù)前均未行放療、化療，半年內(nèi)未經(jīng)過激素治療。兔抗人VEGF-C多克隆抗體及兔抗人VEGFR-3多克隆抗體工作液、SP免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 免疫組化方法 將經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋的宮頸病變標(biāo)本連續(xù)切片2張，采用SP免疫組化染色，使用微波爐抗原熱修復(fù)，抗原修復(fù)液為pH 6.0的檸檬酸緩沖液，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，經(jīng)DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色后，中性樹膠封片。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 VEGF-C VEGF-C的陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色細(xì)顆粒狀，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野(每視野細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè))，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色程度進(jìn)行結(jié)果判定。按陽(yáng)性細(xì)胞比例判定：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%1分，10%～50%2分，>50%3分；按染色程度判定：陰性為0分；淡黃色為1分；中度黃色為2分，棕黃色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞得分×染色程度得分計(jì)總分，總分<3為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.3.2 VEGFR-3 VEGFR-3陽(yáng)性為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。VEGFR-3脈管判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù)方法：低倍鏡下尋找VEGFR-3陽(yáng)性脈管密集區(qū)，即熱區(qū)，100倍視野計(jì)數(shù)5個(gè)熱區(qū)中VEGFR-3陽(yáng)性脈管數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)與秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

VEGF-C在CIN I、CIN Ⅱ組、CIN III組以及ICC組中的陽(yáng)性率分別為6.06%、9.38%、83.78%以及86.67%。VEGFR-3在CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN III組以及ICC組中的陽(yáng)性率分別為9.09%、9.38%、81.08%以及90.00%，見表1。

表1 4組VEGF-C/VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)情況

ICC組VEGF-C、VEGFR-3陽(yáng)性率明顯高于CIN I組和CIN II組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而與CIN III組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CIN III組與CIN I組和CIN II組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；CIN I組與CIN II組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，7例演進(jìn)為ICC的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，有5例發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；在ICC組26例VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)的患者中，有9例發(fā)現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而4例陰性表達(dá)者中，無(wú)一例發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

3 討論

宮頸癌的轉(zhuǎn)移途徑主要是直接蔓延和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤是否已播散到區(qū)域淋巴結(jié)對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生極大影響，臨床多以有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來(lái)評(píng)估預(yù)后及指導(dǎo)治療，Ho等[2]回顧性分析197例早期宮頸癌，根據(jù)其術(shù)后病理分3組，低危組：局限于子宮，無(wú)脈管累及；中危組，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不伴脈管累及，或脈管累及伴間質(zhì)淺層受侵；高危組：脈管累及合并深間質(zhì)浸潤(rùn)，或髂總或腹主動(dòng)脈旁淋巴轉(zhuǎn)移，上述3組的5年無(wú)瘤生存率分別為89%、69%和43%，認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管累及和深間質(zhì)浸潤(rùn)是影響宮頸癌預(yù)后的3大高危病理因素。因此早期預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要臨床意義。緣于VEGF家族的新成員VEGF-C被發(fā)現(xiàn)和研究之后，目前已逐漸成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。

VEGF-C是VEGF家族中的一個(gè)新成員，是淋巴管生成因子，可激活位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-3參與腫瘤內(nèi)和瘤旁淋巴管的生成，與多種腫瘤的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前認(rèn)為，VEGF-C通過結(jié)合并激活VEGFR-3改變淋巴屏障作用[3]，導(dǎo)致淋巴管增生，對(duì)胚胎發(fā)育和腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起重要調(diào)控作用。Yonemura等[4]利用TR-PCR和免疫組化研究85例胃癌中VEGF-C/VEGFR-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中，VEGF-C/VEGFR-3的表達(dá)之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有正相關(guān)。VEGFR-3主要在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，VEGF-C主要在原發(fā)腫瘤中表達(dá)。VEGF-C的表達(dá)和淋巴結(jié)狀況、淋巴的浸潤(rùn)、靜脈的侵襲、腫瘤浸潤(rùn)之間有一個(gè)強(qiáng)的相關(guān)。Fujimoto等[5]研究40例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，24例VEGF-C顯著升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且VEGF-C升高者，24個(gè)月生存率為38%，無(wú)VEGF-C升高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24個(gè)月生存率81%，認(rèn)為宮頸癌中VEGF-C高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移，是判斷預(yù)后的指標(biāo)。Van Trappen等[6]研究VEGF-C及其受體VEGFR-3在103例CIN(CIN I，II和III分別為33，33和37例)和49例宮頸鱗癌中的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果顯示，VEGF-C和VEGFR-3的蛋白表達(dá)在宮頸癌形成的不同分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CIN I，II和III之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CIN III和宮頸癌之間卻無(wú)明顯差異。超過50%的CIN III和宮頸癌中顯示VEGF-C和VEGFR-3中度至強(qiáng)陽(yáng)性染色，而CIN I和II中僅有15%顯示陽(yáng)性表達(dá)。9例演進(jìn)為宮頸癌的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。這些結(jié)果表明，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴血管形成的表型可能發(fā)生在CIN III期。

本研究結(jié)果顯示，CIN I、CIN II組織中幾乎不表達(dá)VEGF-C/VEGFR-3，而CIN III和ICC組織中VEGF-C/VEGFR-3陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，7例演進(jìn)為ICC的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，有5例發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；在ICC組26例VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)的患者中，有9例發(fā)現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而4例陰性表達(dá)者中，無(wú)一例發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴血管形成的表型可能發(fā)生在CIN III期。深刻認(rèn)識(shí)VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，為CIN和ICC的治療開拓了新的視野，提供新的研究方向。隨著檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步和CIN轉(zhuǎn)歸機(jī)制的深入研究，盡早對(duì)CIN實(shí)行干預(yù)，可以降低ICC的發(fā)病率和病死率。

[1]周晨.56例35歲以下浸潤(rùn)性宮頸癌患者預(yù)后因素分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，16（34）：40-42.

[2]Ho CM,Chien TY,Huang SH,et al.Multivariate analysis of the prognostic factors and outcomes in early cervical cancer patients undergoing radical hysterectomy[J].Gynecol Oncol,2004,93(2):458-464.

[3]Breslin JW,Yuan SY, Wu MH.VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells though a VEGFR-3-dependent mechanism[J].Lymphat Res Biol,2007,5(2)：105-l13.

[4]Yonemura Y,Fushida S,Bando E,et a1.Lymphangiogenesis and the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-3 in gastric cancer[J].EurJ Cancer,2001,37(7):9l8-923.

[5]Fujimoto J,Toyoki H,Sato E,et al.Clinical implication of expression of vascular endothelial growth factor-C in metastatic lymph nodes of uterine cervical cancers[J].Br J Cancer,2004,91(3):466-469.

[6]Van Trappen PO,Steele D,Lowe DG,et a1.Expression of vascular endothe1ial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D,and their receptor VEGFR-3,during different stages of cervical carcinogenesis[J].J Pathol,2003,201(4):544-554.