王 穎，于 泓，陳建平，范振海，余麗梅，王 虹，蒲 濤

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099;2.巴淖爾市醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古 巴淖爾市 015000;3.遵義市婦幼保健院內(nèi)科，貴州 遵義 563000;4.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563099)

腎小球疾病是一組以血尿、蛋白尿、水腫和高血壓等為臨床表現(xiàn)的腎臟疾病，是我國慢性腎衰竭的主要病因，大多數(shù)原發(fā)性腎小球疾病(primary glomerulopathy，PG)為免疫介導性炎癥，隨著疾病的進展，除腎小球病變外，還有不同程度的腎小管間質損傷。盡管臨床上仍主要用血肌酐和尿量來評價腎損害和腎功能，但其影響因素眾多，因而研究人員一直在尋找新的生物標志物;近年的研究發(fā)現(xiàn)腎損害分子－1(kidney injury molecule 1，Kim－1)和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)等可用作急性腎損害時的早期標志物，胱抑素C也被逐漸用于臨床，作為比血肌酐更好的反應腎小球濾過功能的指標［1］。其中Kim－1是一種I型跨膜糖蛋白，在正常腎臟幾乎不表達，急性腎損傷時腎小管Kim－1表達和尿液中Kim－1含量均明顯增加［2，3］，但其生物學功能尚未闡明，Kim－1可能參與腎臟疾病的損傷及修復過程，對抗損傷性黏附，參與免疫反應調(diào)節(jié)等。最近國外文獻報道，尿中Kim－1水平也用于IgA腎病、原發(fā)性腎病綜合征伴發(fā)急性腎功能衰竭的腎損害評價［4，5］。因而在初步研究 PG患者腎組織 Kim－1 mRNA的表達情況基礎上，分析其表達水平與腎功能損害和腎臟病理改變的相關性，以此探討Kim－1表達在PG病情評價中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol試劑，逆轉錄試劑盒、Kim－1引物均購自寶生物工程(大連)有限公司;SYBR?GREEN PCR Master Mix購自美國ABI公司;βactin引物購自美國Sigma公司。TU－1810紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司;梯度PCR儀為德國Eppendorf公司;實時熒光定量PCR儀購自美國BIO－RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 病例資料 納入標準:隨機收集遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科2006年9月至2007年1月，符合1992年中華醫(yī)學會腎臟病分會診斷標準的PG住院患者22例，除外其它繼發(fā)因素。其中男16例，女 6例，年齡分布在15～64歲，平均年齡(27.85±14.76)歲。剔除標準:入院時存在缺血、缺氧、明確感染等誘發(fā)腎功能急性加重因素及使用糖皮質激素。分組標準及一般狀況:所有病例按初入院時臨床腎功能狀況分為兩組，估測腎小球濾過率(estimation of glomerular filtration rate，eGFR)≥90 mL/min/1.73 m2為 PG II組，eGFR＜90 mL/min/1.73 m2為PG I組。

1.2.2 腎功能等實驗室檢查 患者入院次日，取清晨空腹靜脈血5 mL，置于普通采血管中，送遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，檢測血漿白蛋白(albumin，Alb)、血肌酐(serum creatinine，Scr)和血尿素(Blood urea，U-rea)等，按簡化MDRD方程計算eGFR，eGFR=186×［Scr］－1.154×［年齡(歲)］－0.203×［女性 ×0.742］［6］，式中Scr單位為mg/dl;同時收集24h尿液，測定24 h尿蛋白量(24h urine protein，UP)。

1.2.3 腎組織病理檢查及組織學評分方法 臨床診斷PG患者，符合經(jīng)皮腎穿刺活檢條件，簽署知情同意書，經(jīng)B超定位腎活檢穿刺患者22例(PG I組9例，PG II組13例)。腎穿刺組織標本送病理科經(jīng)石蠟包埋、切片，常規(guī)行HE、過碘雪夫酸(periodic acid shiff，PAS)、Masson、PASM 染色，進行光鏡檢查，光鏡中腎小球數(shù)≥10個。參考北京大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科IgA腎病簡明半定量病理評分方法［7］，從內(nèi)皮細胞增生、腎小球慢性病變指數(shù)、腎間質炎癥細胞浸潤指數(shù)、系膜細胞增生指數(shù)和腎小管萎縮和腎間質纖維化等8個指數(shù)進行腎臟病理評分(renal pathological scoring，RPS)。

1.2.4 RT real－time PCR 留取部分腎穿刺活檢腎組織，保存于Trizol中，按試劑盒說明書操作步驟提取總RNA，檢測RNA純度與含量，按試劑盒操作說明進行逆轉錄，反應條件:37℃，15 min，85℃，5s。cDNA 產(chǎn)物按照ABI公司SYBR?GREEN PCR Master Mix試劑盒說明書步驟進行定量PCR，反應條件:95℃，8min;95℃，15s，60℃，1min。β － actin 基因上游引物(5'－3')GTCCACCTTCCAGCAGATGTG，下游引物GCATTTGCGGTG GACGAT。

Kim－1基因上游引物(5'－3')GGCATTGTCTGGACCAATGG，下游引物 (3'－5')CTTGAAAGGTCCCCCAATAGC。結果取Ct值，以 βactin為內(nèi)參照進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件包進行統(tǒng)計處理，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換，即取Scr、Kim－1 mRNA表達量和腎臟病理評分的對數(shù)，分別以lgScr、lgKim和lgRPS表示;所有計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，正態(tài)分布資料進行t檢驗及Pearson相關分析，非正態(tài)分布資料則進行秩和檢驗和Spearman相關分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PG患者腎功能檢查 如表1所示，PG II組eGFR)均≥90 mL/min/1.73 m2，明顯高于 PG I組，而PG I組Scr水平明顯高于PG II組的Scr水平(P＜0.01);且PG I組BUN、UP水平也明顯高于正常值和PG II組(P＜0.05，見表1)。

表1 PG患者的腎功能檢查結果Scr，BUN，eGRF，Alb，24h尿蛋白(±s)。

表1 PG患者的腎功能檢查結果Scr，BUN，eGRF，Alb，24h尿蛋白(±s)。

注:vs.PG II組，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

檢測指標 PG I組 PG II組13 lgScr(μmol/L) 2.33 ±0.19＊＊ 1.86 ±0.11 Urea(mmol/L) 14.32 ±5.71* 7.81 ±3.48 eGRF(mL/min/1.73 m2)34.79 ±16.32＊＊ 115.71 ±33.38 Alb(g/L) 28.52 ±8.31 22.04 ±8.88 24 h尿蛋白(g)n 9 4.07 ±0.84 3.85 ±2.19

2.2 腎臟病理改變及評分 PG II組13例患者表現(xiàn)為輕度系膜增生性腎小球腎炎/輕度系膜增生型IgA腎病;PG I組9例患者中，輕度系膜增生性腎小球腎炎/輕度系膜增生型IgA腎病4例，局灶增生硬化性腎小球腎炎2例，增生硬化性腎小球腎炎3例。根據(jù)北京大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科RPS標準，PG I組RPS值顯著高于PG II組(P＜0.01)，其10為底的對數(shù)值lgRPS 分別為1.01 ±0.24 和0.46 ±0.21。

2.3 腎組織中Kim－1 mRNA水平 PG患者腎活檢穿刺腎組織均有Kim－1 mRNA表達，與PG II組比較，PG I組腎組織Kim－1 mRNA表達水平明顯降低，兩組間lgKim相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，見表2)。

表2 PG患者腎組織Kim－1 mRNA表達水平(±s)

表2 PG患者腎組織Kim－1 mRNA表達水平(±s)

注:vs.PG II組，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

lg Kim－1 mRNA PG I組 9 1.58 ±0.58組 別n＊＊PG II組13 2.15 ±0.29

2.4 PG患者腎組織Kim－1 mRNA表達水平與Scr水平、eGFR及RPS的相關與回歸分析如圖1所示，PG患者腎組織Kim－1 mRNA水平的對數(shù)lgKim1與lgScr之間呈負相關，lgKim1與eGFR之間呈正相關;lgKim1與lgRPS評分之間呈負相關，而eGFR與lgRPS之間則呈負相關。上述相關數(shù)據(jù)的直線回歸方程、相關系數(shù)r與P值見表3。lgKim－1、lgRPS與UP、BUN之間沒有明顯的相關性。

表3 PG患者腎組織Kim－1 mRNA表達水平與腎功能、RPS指標間的相關性分析

圖1 PG患者Kim－1 mRNA表達水平與Scr(A)、eGFR(B)、RPS(C)之間，RPS與eGFR之間的散點圖及相關性分析結果

3 討論

Kim－1屬于免疫球蛋白基因超家族，在腎損傷因素作用下，于腎臟近曲小管上皮細胞表達，在金屬蛋白調(diào)節(jié)下，其胞外近膜部位的裂隙處發(fā)生斷裂，使胞外片段被釋放到尿液中。Kim－1作為急性腎小管損害標志物，能迅速、靈敏、特異地反映腎臟的損傷及恢復過程［1，5，8］。

本研究結果顯示，eGFR＜90 mL/min/1.73 m2的PG I組患者，Scr和Urea均高于PG II組，表明PG I組腎功能損傷明顯重于PG II組。PG I組RPS值也大于PG II組，也進一步證明PG I組腎臟組織損傷更為嚴重。排除年齡、性別等影響因素計算所得的eGFR與lgScr之間呈明顯的負相關，而lgScr與lgRPS之間呈正相關，lgRPS對數(shù)值與eGFR之間呈負相關，即PG患者腎組織中腎小球、腎小管及其間質和小動脈病變積分越高，腎組織損害越大，其腎功能降低也越明顯。

輕度系膜增生型原發(fā)性腎病綜合征合并急性腎小管壞死(acute tubule nerosis，ATN)患者尿液Kim－1水平與尿β2－微球蛋白、Scr和腎小管間質病理損害程度呈正相關［4］。IgA腎病患者尿液Kim－1與腎組織Kim－1蛋白表達不但高于正常人，還與Scr、蛋白尿呈正相關，與肌酐清除率呈負相關［5］。但在終末期腎病中尿液Kim－1水平與尿β2－微球蛋白、eGFR卻沒有明顯相關性。本研究中兩組PG患者腎組織均有Kim－1 mRNA表達，且lgKim1 mRNA水平與lgScr正相關，與上述文獻報道相似，但值得關注的是，PG I組患者腎組織lgKim－1明顯低于PG II組者，且lgKim－1與eGFR呈正相關，lgKim－1與lgRPS之間呈負相關。在原發(fā)性腎病綜合征合并ATN等腎臟疾病中，尿液Kim－1水平與Scr呈正相關，即Kim－1高表達除主要反應腎損傷嚴重程度外;在損傷修復過程中Kim－1持續(xù)高表達可能還參與損傷的修復，本研究所顯示的相關關系也進一步支持Kim－1參與腎損傷修復的觀點，提示在PG的慢性疾病進程中，Kim－1的表達不僅反應腎小管間質損害程度，也可能反應腎損傷修復的能力，從而間接影響腎小球濾過功能。

Kim－1的高表達是腎小管上皮細胞凋亡、死亡等損傷的早期或持續(xù)標志［1，9］，且主要表達于再生的近曲小管上皮細胞和去分化上皮細胞，ATN時，Kim－1還可能參與腎小管上皮細胞的去分化與增殖，從而保持腎小管組織形態(tài)和功能的完整性［5，10］。Kim －1 具有“雙刃”性，在不同的腎臟病中，在腎損傷和修復中的病理生理功能也不盡相同［11］。PG患者慢性病變過程中，PG I組RPS較高，而Kim－1 mRNA表達較低，組織病理學檢查可見多數(shù)患者已出現(xiàn)明顯的腎間質炎癥、腎小管萎縮、腎間質纖維化及腎小球增生硬化改變，因而推測在慢性腎功能減退過程中，由于腎小管損傷數(shù)量和程度的增加，可能降低了腎組織Kim－1 mRNA的表達;也提示PG患者出現(xiàn)較為嚴重的慢性腎功能衰退時，Kim－1 mRNA的低表達可能提示腎小管上皮去分化或增生的能力及保持腎組織損傷修復的能力明顯減弱。

lgKim－1與lgRPS之間呈負相關，與原發(fā)性腎病綜合征出現(xiàn)急性腎衰竭患者Kim－1與腎小管損傷程度正相關的結果不盡相同，除本研究所選擇的腎病類型、采用的RPS標準不同外，疾病進程的不同可能是引起這一差異的主要原因，Kim－1在不同腎病中的生物學功能及其臨床意義值得進一步深入研究。

［1］Ichimura T，Hung C C，Yang S A，et al.Urinary kidney injury molecule－1:a sensitive quantitative biomarker for early detection of kidney tubular injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(2):517 －529.

［2］趙飛，王立軍.急性腎損傷新型早期診斷標志物研究進展及評價［J］.醫(yī)學綜述，2010，16(19):2927 －2929.

［3］Ichimura T，Hung C C，Yang S A，et al.Kidney injury molecule－1:a tissue and urinary biomarker for nephrotoxicant－ induced renal injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，286(3):552 －563.

［4］會苗，李紹梅.原發(fā)性腎病綜合征患者尿白介素－18及腎損傷因子－1的檢測及其意義［J］.中國全科醫(yī)學，2010，13(11C):3751 －3754.

［5］Peters H P，Waanders F，Meijer E，et al.High urinary excretion of kidney injury molecule－1 is an independent predictor of end－stage renal disease in patients with IgA nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(11):3581 －3588.

［6］翁敏，白云凱，畢丹青，等.腎小球濾過率評估方程在我國慢性腎臟病人中的適用性［J］.陜西醫(yī)學雜志，2009，38(3):317－319.

［7］蔣鐳，呂繼成.IgA腎病簡明半定量病理評分方法及其與預后的關系［J］.中華腎臟病雜志，2007，23(5):278－282.

［8］McIntire J J，Umetsu S E，Akbari O，et al.Identification of Tapr(an airway hyperreativity regulatory locus)and the linked Tim gene family［J］.Nat Immunol，2001，2(12):1109 －1116.

［9］Ichimural T，Asseldonk E J，Humphregs B D，et al.Kidney injury molecule－1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells［J］.J Clin Invest，2008，118(5):1657 －1668.

［10］Bonventre J V.Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14:S55 – S61.

［11］Huo W，Zhang K，Nie Z，et al.Kidney injury molecule －1(KIM－1):a novel kidney－specific injury molecule playing potential double－edged functions in kidney injury［J］.Transplant Rev(Orlando)，2010，24(3):143 －146.