李曉芬，王炯，李橋麗，高云濤，張公信，周學(xué)進(jìn)

(云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500)

沒(méi)食子酸清除DPPH自由基的微量電化學(xué)滴定

李曉芬，王炯，李橋麗，高云濤，張公信，周學(xué)進(jìn)

(云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500)

電化學(xué)研究表明，沒(méi)食子酸在石墨電極上有一不可逆的氧化峰，峰電位為Epa=0.48 V，且在0.38 V(vs.SCE)處有一靈敏的差分脈沖伏安氧化峰，其峰電流與濃度具有良好的線性關(guān)系，ipa=2.408c+3.028，r=0.999 6.建立了沒(méi)食子酸清除DPPH自由基的新型微量電化學(xué)滴定法，研究了沒(méi)食子酸和DPPH自由基反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，測(cè)得沒(méi)食子酸和DPPH自由基反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比為1∶3，該結(jié)果與光譜分析法相符，并對(duì)沒(méi)食子酸清除DPPH自由基的電化學(xué)氧化機(jī)理進(jìn)行了探討.

沒(méi)食子酸;DPPH自由基;電化學(xué)滴定;化學(xué)計(jì)量;電化學(xué)氧化機(jī)理

沒(méi)食子酸(gallic acid，GA)又稱五倍子酸，化學(xué)名稱為3，4，5－三羥基苯甲酸，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.是一種典型的天然植物酚酸類化合物，也是許多中草藥的有效成分［1－4］.藥理學(xué)研究表明，GA具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗誘變等功效［5－7］.

1，1－二苯基－2－苦基肼(DPPH)自由基是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性［8－13］.目前活性物質(zhì)的抗氧化能力多以清除率達(dá)50%時(shí)的質(zhì)量濃度IC50值為定量評(píng)價(jià)指標(biāo)，但I(xiàn)C50因測(cè)定體系和自由基初始濃度不同而有很大差異，且易受測(cè)定條件影響，因此發(fā)展一種新的、更可靠的評(píng)估方法具有重要意義.本文在對(duì)GA電化學(xué)氧化機(jī)理研究的基礎(chǔ)上提出一種新型微量電化學(xué)滴定分析方法，該法在一定量的GA中逐漸定量加入DPPH，記錄加入DPPH后GA氧化峰電流的變化，根據(jù)滴定結(jié)果計(jì)算GA與DPPH反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，以化學(xué)計(jì)量關(guān)系評(píng)價(jià)活性物質(zhì)的抗氧化活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)GA與DPPH反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

MEC－12B多功能微機(jī)電化學(xué)分析儀(江蘇江分電分析儀器有限公司)，pH－213型酸度計(jì).三電極系統(tǒng):工作電極為石墨電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對(duì)電極為鉑片電極.8453型UV－Vis分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司).

GA標(biāo)準(zhǔn)品(純度﹥99%，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)浙江華東醫(yī)藥有限公司);DPPH(1，1－二苯基－2－苦基肼，純度﹥99%，Sigma公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度﹥99%，購(gòu)于Sigma公司);檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液;配制GA (1 mg/mL)、蘆丁(1 mg/mL)和DPPH(0.1 mg/mL，用無(wú)水乙醇配制)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?經(jīng)分光光度法測(cè)定，DPPH醇溶液的光吸收值可在1 h內(nèi)基本不變.所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 循環(huán)伏安法(CV)

取一定量的1 mg/mL GA溶液于10 mL比色管中，用0.1 mol/L pH=4.40的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋定容，轉(zhuǎn)移至電解池中，接通三電極系統(tǒng)，在0.1～0.8 V電位范圍內(nèi)，以70 mV/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄CV曲線.

1.2.2 差分脈沖伏安法(DPV)

取一定量的1 mg/mL GA溶液于10 mL比色管中，用0.1 mol/L pH=4.40的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋定容，轉(zhuǎn)移至電解池中，接通三電極系統(tǒng)，在0.1～0.8 V電位范圍內(nèi)，以150 ms脈沖寬度、10 mV脈沖幅度、200 ms脈沖間隔進(jìn)行掃描，記錄DPV曲線.作峰電流與濃度的差分脈沖伏安標(biāo)準(zhǔn)曲線.線性方程為ipa=2.408 c+3.028，r=0.999 6，在濃度為1.0×10－7～7.0×10－5mol/L范圍內(nèi)ipa與c呈線性關(guān)系.

1.2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

從GA的循環(huán)伏安曲線可獲得電子轉(zhuǎn)移數(shù)n、質(zhì)子數(shù)m、電子轉(zhuǎn)移系數(shù)α和速率常數(shù)ks等動(dòng)力學(xué)常數(shù)，為推測(cè)物質(zhì)在電極上的電化學(xué)氧化反應(yīng)機(jī)理提供了依據(jù).

1.2.4 微量電化學(xué)滴定

在含有一定量的GA(5.0×10－5mol/L)溶液中，用微量進(jìn)樣器以每次10.0 μL逐漸定量加入1.0× 10－3mol/L DPPH，記錄每次滴加DPPH后GA的DPV曲線及其氧化峰電流.根據(jù)GA的差分脈沖伏安標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GA濃度，根據(jù)DPPH加入量與沒(méi)食子酸的濃度變化關(guān)系繪制電化學(xué)滴定曲線，以達(dá)到最大清除時(shí)DPPH與GA物質(zhì)的量之比，可以確定DPPH與GA反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系.

1.2.5 DPPH分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0，0.5，1，2，3，4，5 mL標(biāo)準(zhǔn)液在25 mL比色管中定容至刻度，其質(zhì)量濃度依次為:0，1，2，4，6，8，10 μg/mL.在516 nm處測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.得到其線性回歸方程為:A=0.027 9 c+ 0.000 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，表明DPPH濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系.

1.2.6 GA對(duì)DPPH自由基的清除作用

準(zhǔn)確移取4.5 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL比色管中，分別加入不同濃度的GA標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白管為4.5 mL DDPH標(biāo)準(zhǔn)液，并用無(wú)水乙醇定容至5.0 mL，置于暗處?kù)o置30 min，取出后以無(wú)水乙醇為參比于516 nm處分別測(cè)定其吸光度.計(jì)算其清除率，并與蘆丁進(jìn)行對(duì)照，清除率按下式計(jì)算:

式中:A0為空白管的吸光度;A樣為樣品管的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)伏安(CV)分析

圖2中a是GA的循環(huán)伏安曲線，b、c是GA中加入DPPH溶液后的循環(huán)伏安曲線.從圖2a可知，石墨電極在底液(檸檬酸－磷酸氫二鈉)中不出峰，加入一定量的GA標(biāo)準(zhǔn)溶液后，GA在Epa=0.48 V處出現(xiàn)1個(gè)明顯的氧化峰，說(shuō)明GA在石墨電極上發(fā)生了不可逆的電化學(xué)氧化反應(yīng)，氧化產(chǎn)物不易在電極表面上還原出來(lái).當(dāng)在GA溶液中加入不同濃度的DPPH時(shí)，GA的峰電流明顯減少，DPPH濃度越高，GA峰電流越低，表明GA被DPPH所消耗，同時(shí)峰電位也發(fā)生了負(fù)移.

2.2 差分脈沖伏安(DPV)分析

GA的差分脈沖伏安圖見(jiàn)圖3中的a曲線所示，GA在0.38 V處有一靈敏的氧化峰，峰電流與GA濃度具有良好的線性關(guān)系，ipa=2.408c+3.028(r=0.999 6)，說(shuō)明通過(guò)氧化峰電流可以定量計(jì)算GA的濃度.圖3中的b～e曲線是GA中加入不同濃度的DPPH后峰電流的變化，從圖可知，在GA中加入不同濃度的DPPH后，GA的氧化峰電流呈線性減少，可計(jì)算出加入量與峰電流的關(guān)系.

表1 GA氧化峰電流與掃速的線性關(guān)系

2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

2.3.1 電子轉(zhuǎn)移數(shù)n的測(cè)定

電子轉(zhuǎn)移數(shù)n是電極反應(yīng)參數(shù)之一，由圖4及表1可知GA的峰電流和掃速呈線性關(guān)系，反應(yīng)過(guò)程又受吸附控制，此吸附體系滿足Laviron理論中Langmuir吸附等溫式:

式中Q為循環(huán)伏安單一過(guò)程的峰面積(以電量計(jì));ipa為氧化峰電流;F=96 485 C/mol;R= 8.314 5 J/(K·mol);T=298.15 K;ΓT為吸附量(mol·cm－2);A為石墨電極的面積，約為0.282 6 cm2.由式(1)可知，只需測(cè)得某掃描速度下的峰面積和ipa值，即可求得n，從而通過(guò)式(2)再求出ΓT.經(jīng)計(jì)算可知，掃速為0.07 V/s時(shí)，GA的電子轉(zhuǎn)移數(shù)n為3.01，則吸附量ΓT分別為2.27×10－10mol/cm2.

2.3.2 參加電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)m的測(cè)定

由圖5和圖6可知，底液的酸度是影響物質(zhì)峰電位和峰電流的重要因素之一，底液pH值不同，同等濃度的GA在電極上的電化學(xué)響應(yīng)不同，則參與電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)m可由底液pH值對(duì)峰電位的影響來(lái)求得.根據(jù)能斯特方程:

由式(3)可知，只需繪制出Epa－pH的關(guān)系圖，其斜率k=0.059 m/n(溫度為25℃)，由n即可求解出參加電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)m，Epa－pH的線性關(guān)系見(jiàn)圖7，線性方程見(jiàn)表2.

由以上研究可知，GA在電極上發(fā)生了3個(gè)電子和3個(gè)質(zhì)子的電化學(xué)氧化反應(yīng)，可推知GA的電化學(xué)反應(yīng)為羥基被氧化為酮基的過(guò)程，可能的反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)圖8.

表2 GA的峰電位Epa與pH值的線性關(guān)系

2.4 GA和DPPH的電化學(xué)滴定曲線

在5.0×10－5mol/L的GA溶液中逐漸滴加濃度為4.0× 10－4mol/L的DPPH，測(cè)定GA的氧化峰電流，根據(jù)GA氧化峰電流與濃度關(guān)系計(jì)算出加入DPPH后GA的濃度變化，繪制DPPH加入量與余下GA的物質(zhì)的量的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖9所示.從圖9可知，加入DPPH后，GA的氧化峰電流迅速下降，但DPPH加入量達(dá)到一定濃度時(shí)，GA的氧化峰電流趨于穩(wěn)定，表明所加入的GA很大部分已經(jīng)被DPPH消耗，其拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)達(dá)到最大清除時(shí)DPPH和GA反應(yīng)完全時(shí)的化學(xué)計(jì)量點(diǎn).通過(guò)計(jì)算化學(xué)計(jì)量點(diǎn)時(shí)DPPH加入量與已消耗GA物質(zhì)的量的比值，可以確定DPPH與GA的化學(xué)計(jì)量關(guān)系.圖9中2條切線相交的坐標(biāo)值視為溶液中剩余的GA和加入DPPH的物質(zhì)的量比.經(jīng)計(jì)算，達(dá)到最大清除時(shí)，GA與DPPH的化學(xué)計(jì)量比約為1∶3，也就是說(shuō)1 mol的GA可以清除約3 mol的DPPH，該計(jì)量關(guān)系表明了GA清除DPPH的能力，此結(jié)果與光譜學(xué)研究的結(jié)果相符.

通常GA等具有遞電子和遞質(zhì)子能力的抗氧化劑對(duì)DPPH的清除作用是通過(guò)抗氧化劑把電子和質(zhì)子傳遞給DPPH，從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)DPPH2［15］，其反應(yīng)式見(jiàn)圖10.結(jié)合GA與DPPH的滴定曲線，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步推出GA和DPPH的電化學(xué)反應(yīng)方程式為圖11.該反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系與GA和DPPH得失電子數(shù)相符.

2.5 GA清除DDPH自由基的光譜學(xué)研究

將DPPH在516 nm處的吸光度值與質(zhì)量濃度作線性回歸分析，得到方程:A=0.027 9 c+0.000 8，其相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，表明DPPH濃度與其吸光度呈正相關(guān)關(guān)系.GA與蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖12.清除率隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，達(dá)到一定濃度時(shí)，清除率保持穩(wěn)定.當(dāng)清除率達(dá)50%時(shí)，GA的質(zhì)量濃度為:IC50=0.000 92 mg/mL，GA的質(zhì)量濃度≥0.002 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)最大，為79.17%.當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)，蘆丁的質(zhì)量濃度為:IC50=0.003 992 mg/mL，蘆丁的質(zhì)量濃度≥0.008 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)最大為74.46%.這說(shuō)明GA對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，且明顯強(qiáng)于相同濃度下的蘆丁.在光譜學(xué)研究中，DPPH為2.739 mmol時(shí)樣品達(dá)最大清除率所消耗的GA是0.93 mmol，二者比例為1∶3，此結(jié)果與電化學(xué)研究的結(jié)果相符.光譜法IC50值和最大清除率80%的結(jié)果也與微量電化學(xué)滴定法獲得的化學(xué)計(jì)量結(jié)果相符，因此證明微量電化學(xué)計(jì)量法用于評(píng)定活性物質(zhì)的抗氧化活性是可靠的.

3 結(jié)論

本文提出一個(gè)新的測(cè)定和評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的微量電化學(xué)滴定方法.該方法能獲得抗氧化劑與自由基的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，利用該化學(xué)計(jì)量關(guān)系可更好的評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基的活性，解決了常規(guī)的IC50評(píng)價(jià)方法受體系和自由基初始濃度影響較大的不足.該方法具有穩(wěn)定可靠、快速簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn).本文提出的微量電化學(xué)滴定法還能獲得抗氧化劑和自由基反應(yīng)機(jī)理的微觀信息，較常規(guī)的光譜方法具有明顯的優(yōu)勢(shì).

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(責(zé)任編輯戴云)

Micro－Electrochemical Titration Analysis of the Scavenging Effect of Gallic Acid on DPPH Free Radicals

LI Xiao-fen，WANG Jiong，LI Qiao-li，GAO Yun-tao，ZHANG Gong-xin，ZHOU Xue-jin
(Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China)

The electrochemical results indicated that gallic acid presented typical irreversible oxidation processes，and an irreversible oxidation peak was observed with the peak potentials of 0.48V(vs.SCE)on the graphite electrode.A sensitive differential pulse voltammetry anodic peak at Epa=0.38V(vs.SCE)was also detected with a good linear relationship between the peak current and the concentration:ipa=2.408 c+3.028，r=0.999 6.A novel micro－electrochemical titration method for evaluating the scavenging effect of gallic acid on DPPH free radicals was proposed，the stoichiometric relationship of gallic and DPPH was determined with a stoichiometric proportion of 1∶3(gallic to DPPH)，which was coincident with the results of spectrophotometry.Electrochemical oxidation mechanism of the scavenging effect of gallic acid on DPPH free radicals was also investigated.

gallicacid;DPPHfreeradical;electrochemicaltitration;stoichiometry;electrochemical oxidation mechanism

O 657.7;R 284.1

A

1672－8513(2012)04－0243－06

10.3969/j.issn.1672－8513.2012.04.003

2011－08－29.

云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011HC008);民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(MJY07010).

李曉芬(1986－)，女，碩士研究生.主要研究方向:分析化學(xué).

高云濤(1962－)，男，教授，碩士生導(dǎo)師.主要研究方向:分析化學(xué).