嚴(yán) 海 齊 玲金 宏趙東海溫 娜于洪泉

(北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦外科，吉林 吉林 132022)

TRAIL聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制

嚴(yán) 海 齊 玲1金 宏1趙東海1溫 娜1于洪泉2

(北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦外科，吉林 吉林 132022)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;順鉑;腦質(zhì)瘤

作為新型的抗腫瘤藥物，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可以誘導(dǎo)包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但大多惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥〔2〕。前期研究的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性不同，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)死亡受體(DR)5的表達(dá)量不同，并當(dāng)TRAIL與化療藥物聯(lián)合作用后可發(fā)揮協(xié)同作用〔3～5〕。因此，本文進(jìn)一步對(duì)TRAIL與化療藥物聯(lián)合作用誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究，為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 小牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech 公司);順鉑(cisplatin，Sigma公司);鼠抗人Caspase-8單克隆抗體(Cell Signaling公司);兔抗人肌動(dòng)蛋白(Actin)多克隆抗體(Sigma公司);過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠(兔)IgG第二抗體(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出凍存的早期原代惡性膠質(zhì)瘤 GC125 細(xì)胞〔4，6〕，復(fù)蘇后離心棄上清，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10%DMEM/F12培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代。

1.3 Western印跡檢測(cè)藥物作用后惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況〔3〕將細(xì)胞分為四組，分別為對(duì)照組(不加藥物)、TRAIL組(300 ng/ml)、聯(lián)合用藥組(TRAIL 300 ng/ml+順鉑10 μg/ml)、順鉑組(10 μg/ml)。待細(xì)胞生長(zhǎng)90%左右，加入藥物作用3 h。收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，3 000 r/min離心5 min棄上清。PBS再次充分洗滌細(xì)胞，離心棄上清，每個(gè)樣品加入50 μl的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃離心15 min，上清移于另一管中，棄沉淀，Braford法檢測(cè)樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠分離樣品，4℃轉(zhuǎn)膜封閉后，加入一抗4℃孵育過夜。加入相應(yīng)的二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

2 結(jié)果

加入TRAIL和(或)順鉑后觀察GC125細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)情況。在聯(lián)合用藥組可見到明顯的凋亡小體，并且隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量明顯增多;在藥物作用于細(xì)胞3 h后提取蛋白，每孔加入80 μg蛋白，跑膠分離蛋白，并加入Caspase-8抗體。曝光后可見到細(xì)胞發(fā)生Caspase-8裂解反應(yīng)。見圖1。

圖1 惡性膠質(zhì)瘤GC125細(xì)胞經(jīng)TRAIL聯(lián)合順鉑作用后發(fā)生凋亡級(jí)聯(lián)裂解反應(yīng)的情況

3 討論

美國(guó)腦腫瘤注冊(cè)中心2008年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，惡性膠質(zhì)瘤占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%，年發(fā)病率為5/100 000，每年新發(fā)病例超過14 000例。但由于惡性膠質(zhì)瘤在腦內(nèi)呈彌散分布〔7〕，故手術(shù)難以清除。這可能是由于激活細(xì)胞生長(zhǎng)途徑和(或)抑制細(xì)胞凋亡途徑而對(duì)治療抵抗〔8〕。作為研究的熱點(diǎn)，TRAIL雖可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但卻存在著耐藥現(xiàn)象，迄今為止，科研人員還在對(duì)攻克這一難題做著不懈的努力。

TRAIL作用于細(xì)胞后與細(xì)胞表面的DR5結(jié)合，再通過胞內(nèi)受體的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)募集胞內(nèi)特異性的凋亡相關(guān)因子(FAS)相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)，F(xiàn)ADD上的死亡效應(yīng)域(DED)又募集Caspase-8前體，通過裝配成DR5-FADD-Caspase-8死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)激活Caspase-8，引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)裂解反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡〔9〕。Caspase-8有兩種同分異構(gòu)體P55和P53，通過DED，Caspase-8被FADD募集到DISC，經(jīng)兩步自體蛋白水解過程釋放P18、P10兩個(gè)亞單位，Caspase-8發(fā)生活化裂解引起細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤GC125細(xì)胞進(jìn)行研究，應(yīng)用TRAIL與順鉑分別或聯(lián)合作用于細(xì)胞后，經(jīng)Western印跡檢測(cè)顯示，對(duì)照組與順鉑組均未見明顯的Caspase-8凋亡級(jí)聯(lián)裂解反應(yīng)，TRAIL組可見到少量的Caspase-8二步裂解產(chǎn)物P18片段，聯(lián)合用藥組則可見到明顯的P18裂解片段。初步說明TRAIL與順鉑聯(lián)合作用后，可增強(qiáng)TRAIL的誘導(dǎo)凋亡作用，使惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是通過增加細(xì)胞Caspase-8活化而引起。但惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生TRAIL耐藥的機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

3 南栗巖，齊 玲，肖振晶，等.原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)死亡受體與TRAIL抵抗的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(18):3591-2.

4 嚴(yán) 海，張 宇，于洪泉，等.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(8):1355-6.

5 金 宏，張 宇，于洪泉，等.壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體聯(lián)合化療藥物對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的殺傷作用〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011;28(7):639-40.

6 齊 玲，金 宏，丁麗娟，等.腦腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(2):227-8.

7 Holland EC，Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-4.

8 Smyth MJ，Takeda K，Hayakawa Y，et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy〔J〕.Immunity，2003;18(1):1-6.

9 Bellail AC，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

〔2012-01-18收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 袁左鳴)

R739.41

A

1005-9202(2012)17-3751-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.062

吉林省自然科學(xué)基金(No.202015242);吉林省教育廳項(xiàng)目(No.2012330，2011281);吉林醫(yī)藥學(xué)院留學(xué)歸國(guó)博士科研啟動(dòng)基金(No.201101)

1 吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室 2 吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院神經(jīng)外科

于洪泉(1974-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腦膠質(zhì)瘤綜合治療研究。

嚴(yán) 海(1974-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦腫瘤藥物治療研究。