王紹清 于秀文 趙春明 胡 南 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

通過下調(diào)Lewis肺癌細(xì)胞Vav3基因的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖

王紹清 于秀文 趙春明 胡 南 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 通過下調(diào)Lewis肺癌細(xì)胞Vav3基因的表達(dá)，觀察Vav3表達(dá)對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響。方法 設(shè)計(jì)合成3條針對(duì)小鼠Vav3的小干擾RNA序列(Vav3-mus-163，Vav3-mus-309，Vav3-mus-375)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至Lewis肺癌細(xì)胞，采用Real-time PCR和Western印跡方法檢測(cè)干擾前后Vav3的表達(dá)，并挑選出下調(diào)效果最好的一條干擾序列進(jìn)行細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)，分別在24、、72 h觀察下調(diào)Vav3基因表達(dá)后對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響。結(jié)果 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染三條siRNA序列Vav3-mus-163、Vav3-mus-309、Vav3-mus-375，檢測(cè)Vav3基因相對(duì)表達(dá)含量分別為1.121 7±0.105 5、2.030 5±0.386 1和3.175 9±0.730 4。分別與Lewis肺癌細(xì)胞組(6.704 5±0.183 3)和陰性對(duì)照組(6.083 7±0.317 2)相比，轉(zhuǎn)染Vav3-mus-163組和轉(zhuǎn)染Vav3-mus-375組的Lewis肺癌細(xì)胞Vav3基因表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01，P＜0.05)。在蛋白水平瞬時(shí)轉(zhuǎn)染三條小干擾RNA序列Vav3的表達(dá)分別為0.112 8±0.005 8、0.203 2±0.008 3、0.293 8±0.219 1，與Lewis肺癌細(xì)胞組(0.408 3±0.004 6)和陰性對(duì)照組(0.388 9±0.005 4)比較，轉(zhuǎn)染Vav3-mus-163組Vav3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。Vav3-mus-163序列能夠在mRNA水平和蛋白水平顯著下調(diào)Vav3的表達(dá)。MTT法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Vav3-mus-163后72 h細(xì)胞的增殖率為78.4%，與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖率92.9%相比差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論 下調(diào)Lewis肺癌細(xì)胞中Vav3的表達(dá)，可使癌細(xì)胞的增殖能力下降，說明Vav3具有促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞增殖的作用。Vav3表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。

Vav3;小干擾RNA;Lewis肺癌細(xì)胞;增殖

鳥嘌呤核苷酸交換因子(Vav)3屬于Vav家族成員之一，活化的Vav可以催化Rho家族GTP酶活化蛋白(GTPase)結(jié)合的GDP變?yōu)镚TP，從而激活GTPase活性，在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏著斑通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔1〕。有研究表明 Vav3 具有原癌基因的功能〔2，3〕。本文通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)序列下調(diào)Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)中Vav3中的表達(dá)，觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響，進(jìn)一步闡明Vav3在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LCC購(gòu)自湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)公司，一抗山羊Vav3 antibody，二抗兔抗山羊IgG/辣根過氧化物酶(HRP)(Santa Cruz);Opti-MEM?I低血清培養(yǎng)基，LipofectamineTM2000(Sigma);蛋白提取試劑盒(ProMab);MTT檢測(cè)試劑盒(KGA);Trizol(Invitrogen);RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit、Deoxyribonuclease I、RiboLockTMRibonuclease Inhibitor(Fermentas)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LCC培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 siRNA序列合成 四條siRNA雙鏈由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Vav3-mus-163:正義5'UGG ACC CAG GUU UGC CGA ATT 3'，反義 5'UUC GGC AAA CCU GGG UCC ATT 3';Vav3-mus-309:正義5'GGA CGA AAC UUA GCU UCA GTT 3'，反義 5'CUG AAG CUA AGU UUC GUC CTT3';Vav3-mus-375:正義 5'GUA CCU AAA CCA GUA GAU UTT 3'，反義 5'AAU CUA CUG GUU UAG GUA CTT 3';熒光標(biāo)記陰性對(duì)照(Negative control，NC-FAM):正義 5'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3'，反義 5'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3'。鼠GAPDH-420:正義 5'CAC UCA AGA UUG UCA GCA ATT 3'，反義5'UUG CUG ACA AUC UUG AGU GAG 3'。

1.2.3 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為5組:組1為未作處理組(LLC);組2:轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性序列對(duì)照組(Vav3-mus-NC);組3:轉(zhuǎn)染 Vav3-mus-163;組4:轉(zhuǎn)染 Vav3-mus-309;組5:轉(zhuǎn)染Vav3-mus-375。

將5×104LCC接種在6孔板上，每孔含2 ml 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后細(xì)胞融合達(dá)到70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染 。250 μl Opti-MEM?I稀釋5 μl LipofectamineTM2 000，混勻室溫下孵育5 min。250 μl Opti-MEM?I稀釋 7.5 μl siRNA，室溫下混勻。上述兩種液體混合，在室溫下孵育20 min，形成復(fù)合物。將siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到接種細(xì)胞的六孔板中并混合。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h，對(duì)轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性序列對(duì)照組進(jìn)行熒光檢測(cè)并更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;孵育48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行Western印跡、Real-time PCR檢測(cè)。

1.2.4 Western印跡 提取細(xì)胞總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。加入一抗山羊Vav3抗體(1∶400)，室溫結(jié)合3 h。加入二抗兔抗山羊(1∶4 000)，室溫結(jié)合1 h。PVDF膜依次與抗體作用后與免疫印跡化學(xué)發(fā)光。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。選取下調(diào)效果最好的siRNA序列進(jìn)行后續(xù)MTT實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Real-time PCR 總RNA提取:每樣孔加入0.8 ml Trizol，按試劑使用說明提取細(xì)胞總RNA。基因組DNA的去除:按順序依次加入總 RNA 1 μg，10×反應(yīng)緩沖液 1 μl，Ribo-LockTMRibonuclease9 μl，再加入 DNase I(1 U/μl)1 μl，37℃孵育 30 min;加入 1 μl 25 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，65℃溫育10 min使酶失活。

反 轉(zhuǎn) 錄 (20 μl 體 系): 總 RNA 2 μg，Oligo(dT)18(0.5 μmol/μl)1 μl，加入 DEPC 處理水至 11 μl，70℃ 5 min，冰上冷卻。5×反應(yīng)緩沖液 4 μl，4種 dNTP混合物(10 mmol/μl)2 μl，Ribonuclease 抑制劑(40 U/μl)0.5 μl，37℃ 5 min。Revert AidTMM-MulV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (200 U/μl)1 μl，42℃ 60 min，70℃10 min后置于冰上。

Real-time PCR(25 μl體系):取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μl，Vav3及GAPDH上下游各100 mmol/L，2×SYBR Green PCR Master混合液 12.5 μl，加 ddH2O至 25 μl。然后按下述條件反應(yīng):95℃ 5 min，94℃ 20 s，(Vav3 基因 56℃、GAPDH 基因 59℃)20 s，72℃ 20 s共40 個(gè)循環(huán)，72℃ 20 s，55℃ 10 s。見表1。

表1 小鼠Vav3及GAPDH擴(kuò)增序列

1.2.6 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 實(shí)驗(yàn)步驟按MTT檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。在96孔板加入細(xì)胞100 μl/孔(1×104個(gè)細(xì)胞)，置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加50 μl 1 × MTT，在 37℃ 孵育 4 h。吸出上清液，每孔加 150 μl DMSO使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。細(xì)胞存活率% =(干擾組細(xì)胞OD－本底OD/對(duì)照細(xì)胞OD－本底OD)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示，資料數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染率檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后6 h，通過比對(duì)帶有熒光標(biāo)記的對(duì)照組細(xì)胞熒光鏡與光鏡下圖像，觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70%以上。

2.2 Real-time PCR檢測(cè) 目的基因的擴(kuò)增曲線符合4個(gè)特征性階段的平滑的S型曲線，陰性對(duì)照(模板為水)無顯著熒光信號(hào)，目的基因得到有效擴(kuò)增。在熔點(diǎn)曲線中顯示形狀只有一個(gè)峰值，沒有出現(xiàn)雜峰，提示無非特異性熒光信號(hào)，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物單一。用2－ΔΔCt表示樣品中Vav3 mRNA相對(duì)定量。Vav3 mRNA相對(duì)含量在第3組、第4組細(xì)胞中表達(dá)較1、2組明顯下調(diào)(P＜0.001，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 Western印跡分析 轉(zhuǎn)染Vav3-mus-163序列的第3組細(xì)胞中Vav3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。半定量分析蛋白表達(dá)的光密度值，第3組細(xì)胞中Vav蛋白表達(dá)下調(diào)明顯，與第1組及第2組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VAV3-siRNA-163對(duì)Vav3基因的沉默效應(yīng)最好，可以用于后續(xù)MTT實(shí)驗(yàn)。見圖1，表2。

2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 分別在轉(zhuǎn)染VAV3-siRNA-163后24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后72 h LLC增殖能力明顯下降，與第1組及第2組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Vav3蛋白表達(dá)

表2 各組細(xì)胞中Vav3 mRNA和蛋白相對(duì)含量(±s，n=4)

表2 各組細(xì)胞中Vav3 mRNA和蛋白相對(duì)含量(±s，n=4)

與組1、組2比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01;下表同

組別 Vav3 mRNA Vav3蛋白組1 3.175 9±0.730 4 0.293 8±0.219 1 6.704 5±0.183 3 0.408 3±0.004 6組2 6.083 7±0.317 2 0.388 9±0.005 4組3 1.121 7±0.105 52)0.112 8±0.005 81)組4 2.030 5±0.386 11)0.203 2±0.008 3組5

表3 各組細(xì)胞72 h的OD值(±s，n=4)

表3 各組細(xì)胞72 h的OD值(±s，n=4)

與1組、2組比較:1)P＜0.05

組別 OD值 增殖率(%)組1 78.4 0.792 5±0.142 0 100.0組2 0.736 0±0.184 5 92.9組3 0.621 5±0.104 71)

3 討論

Vav3基因定位于1號(hào)染色體，蛋白表達(dá)于胞質(zhì)中，分子量為97 kD，在體內(nèi)廣泛分布。Vav3作為一種鳥嘌呤交換因子參與多種信號(hào)通路傳導(dǎo)及細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程調(diào)節(jié)〔1〕。靜息狀態(tài)下Vav3 Ac結(jié)構(gòu)域上174位的酪氨酸殘基的磷酸化是Vav3活化的關(guān)鍵，上游Src家族及Syk家族酪氨酸蛋白激酶可以通過這種磷酸化形式激活Vav3〔4〕。活化后的Vav3通過C3肉毒素底物/蛋白活化激酶(Rac1/PAK)通路調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)功能，對(duì)維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)可能發(fā)揮重要作用〔5，6〕。原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)顯示，Vav3促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞樹突分支發(fā)育，而且在Vav3缺失小鼠模型中對(duì)小鼠小腦發(fā)育過程起重要的調(diào)節(jié)作用〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，Vav1/2/3缺失小鼠模型產(chǎn)生無效應(yīng)的T細(xì)胞或B細(xì)胞，而且T細(xì)胞受體通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路也被破壞，說明Vav3參與T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育過程〔8〕。已有研究表明Vav3在多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加〔2，3，9，10〕，具有原癌基因的功能。在前列腺癌〔2〕和乳腺癌〔3〕的癌細(xì)胞中Vav3表達(dá)增加，并且通過磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路激活A(yù)R及ERα活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果提示，Vav3表達(dá)下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞增殖率降低，說明Vav3在調(diào)控LLC生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要的作用。作為一種鳥嘌呤調(diào)節(jié)因子，Vav3在相應(yīng)的刺激因子作用下發(fā)揮其鳥嘌呤交換因子(GEF)活性，調(diào)節(jié)Rho家族GTPase活性，如Rac1、Cdc42、RhoA，進(jìn)一步激活 MAPK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路，發(fā)揮改變細(xì)胞形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生物學(xué)效應(yīng)，或者通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等轉(zhuǎn)錄水平的活性促進(jìn)細(xì)胞增殖〔10〕。Vav3在調(diào)控LLC生長(zhǎng)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次在細(xì)胞水平初步證實(shí)了Vav3在LLC中的表達(dá)及Vav3的表達(dá)與細(xì)胞增殖能力有關(guān)，Vav3在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能有著重要的作用。

1 Movilla N，Bustelo XR.Biological and regulatory properties of Vav-3，a new member of the Vav family of oncoproteins〔J〕.Mol Cell Biol，1999;19(11):7870-85.

2 Dong ZY，Liu Y，Levin L，et al.Vav3 oncogene is involved in regulation of secretory phospholipase A2-Ⅱa expression in prostate cancer〔J〕.Oncol Rep，2011;25(6):1511-6.

3 Lee K，Liu Y，Mo JQ，et al.Vav3 oncogene activates estrogen receptor and its overexpression may be involved in human breast cancer〔J〕.BMC Cancer，2008;8(1):158.

4 Bustelo XR.Regulatory and signaling properties of the Vav family〔J〕.Mol Cell Biol，2000;20(5):1461-77.

5 Sauzeau V，Sevilla MA，Rivas-Elena JV，et al.Vav3 proto-oncogene deficiency leads to sympathetic hyperactivity and cardiovascular dysfunction〔J〕.Nat Med，2006;12(7):841-5.

6 Toumaniantz G，F(xiàn)erland-McCollough D，Cario-Toumaniantz C，et al.The Rho protein exchange factor Vav3 regulates vascular smooth muscle cell proliferation and migration〔J〕.Cardiovasc Res，2010;86(1):131-40.

7 Quevedo C，Sauzeau V，Menacho-Márquez M，et al.Vav3-deficient mice exhibit a transient delay in cerebullar development〔J〕.Mol Biol Cell，2010;21(6):1125-39.

8 Fujikawa K，Miletic AV，Alt FW，et al.Vav1/2/3-null mice define an essential role for Vav family proteins in lymphocyte development and activation but a differential requirement in MAPK signaling in T and B cells〔J〕.J Exp Med，2003;198(10):1595-608.

9 Sal hia B，Tran NL，Chan A，et al.The gluanine nucleotide exchange factors trio，Ect2，and Vav3 mediate the invasive behavior of glioblastoma〔J〕.Am J Pathol，2008;173(6):1828-38.

10 Falmby TR，Abe K，Kamoub AE，et al.Vav transformation requires activation of multiple GTPases and regulation of gene expression〔J〕.Mol Cancer Res，2004;2(12):702-11.

〔2012-01-04收稿 2012-01-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2012)17-3726-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.051

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2010-231)

王紹清(1979-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤遺傳學(xué)方面的研究。