汪金峰 李云橋 (華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430022)

肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS表達變化

汪金峰 李云橋 (華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430022)

目的 探討γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)在肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌中的表達變化與細胞凋亡的關(guān)系。方法 采用單純熏香煙法制作肺氣腫小鼠模型。運用TUNEL法檢測骨骼肌、心肌細胞凋亡，免疫組化技術(shù)檢測上述組織γ-GCS的蛋白水平，結(jié)果以平均光密度值表示。結(jié)果 肺氣腫小鼠骨骼肌心肌細胞凋亡均增加(0.20±0.07 vs 0.36±0.04，t=－4.583，P=0.001;0.20±0.02 vs 0.29±0.07，t=－3.433，P=0.009)。肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平分別為0.210±0.026、0.38±0.09，與正常組骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平0.086±0.008、0.19±0.03相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.917，P＜0.001，t=－4.616，P=0.001);肺氣腫小鼠骨骼肌與心肌γ-GCS蛋白水平相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－4.092，P=0.014)。結(jié)論 肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌細胞凋亡增加，其機制可能與γ-GCS介導(dǎo)的氧化/抗氧化失衡有關(guān)，骨骼肌較心肌細胞凋亡加重，可能與γ-GCS表達減少有關(guān)。

肺氣腫;γ谷氨酰半胱氨酸合成酶;小鼠;骨骼肌

目前關(guān)于肺氣腫的發(fā)病機制學(xué)說主要有:氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及慢性氣道和肺部炎癥形成〔1〕等。研究表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧是造成多系統(tǒng)、多器官氧化損傷的共同基礎(chǔ)。還原型谷胱甘肽(GSH)是細胞內(nèi)外主要的抗氧化劑，對維護組織細胞正常結(jié)構(gòu)、功能及代謝起重要作用。γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是GSH生物合成中的關(guān)鍵酶〔2〕。已有研究表明:γ-GCS高表達于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺泡和支氣管上皮細胞中〔3〕。為進一步探討γ-GCS對全身其他器官的影響，本文就肺氣腫小鼠模型骨骼肌、心肌組織中γ-GCS的表達變化與細胞凋亡的關(guān)系進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉公司;γ-GCS抗體為美國Santa Crus公司產(chǎn)品。

1.1.2 動物模型和標本采集 雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量24～26 g(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物研究所提供)，分為正常對照組(10只)及肺氣腫組(20只)。肺氣腫組制模采用單純熏香煙法〔4〕，以常規(guī)飼料喂養(yǎng)小鼠，吸煙時動物置于帶有透氣孔的玻璃箱內(nèi)，每次通過吸煙器燃燒5根去過濾咀的紅雙喜牌香煙(焦油含量每支13 mg，煙霧煙堿每支1.3 mg)，使動物暴露于煙霧中被動吸煙，每周吸煙6 d，每日吸煙2次，每次約1～1.5 h。16 w后，頸椎脫臼法處死動物，取出趾長肌、心肌組織，于10%甲醛溶液固定，采用免疫組織化學(xué)染色。

1.2 方法

1.2.1 肺組織切片的制作 熏香煙16 w后，頸椎脫臼法處死動物，迅速開胸，小心取出肺組織，在肺葉中線矢狀面切取肺組織并以石蠟包埋，制作6 μm厚的切片，并用HE染色。

1.2.2 骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白表達及細胞凋亡測定 蛋白表達采用親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(ABC)免疫組織化學(xué)染色試劑盒，根據(jù)試劑盒提供的操作說明進行;細胞凋亡用末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測，圖像經(jīng)HMIAS-2000型全自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，兩組計量資料比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肺氣腫小鼠模型肺組織病理特點 在肺組織切片中，可見肺氣腫模型小鼠肺泡間隔變薄甚至斷裂，多個肺泡融合形成肺大泡，呈現(xiàn)肺氣腫樣特征改變，而正常對照組小鼠各肺泡壁連接清楚，肺泡大小均一，未見明顯肺泡融合，見圖1。

2.2 骨骼肌心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達及細胞凋亡的變化以辣根過氧化物酶標記的二抗顯示正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達，在肺氣腫組與底物大量結(jié)合，顯示明顯的棕黃色，而正常組棕黃色底物明顯減少，見圖2。肺氣腫小鼠骨骼肌心肌細胞凋亡均增加(P=0.005)。肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白水平與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。肺氣腫小鼠骨骼肌與心肌γ-GCS蛋白水平相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。見表1。

TUNEL法檢測顯示棕黃色底物在肺氣腫組骨骼肌、心肌組織切片中明顯增多，而正常組骨骼肌、心肌組織切片中較少看到，細胞凋亡程度與棕黃色底物濃度呈正相關(guān)，見圖3。

圖1 兩組小鼠肺組織病理特點(HE，×200)

圖2 正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達(免疫組化，×400)

圖3 正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)細胞凋亡(免疫組化，×400)

表1 兩組骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表達(±s，n=20)

表1 兩組骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表達(±s，n=20)

組別 骨骼肌凋亡 γ-GCS心肌凋亡 γ-GCS正常組0.20±0.07 0.086±0.008 0.20±0.02 0.19±0.03肺氣腫組 0.36±0.04 0.210±0.026 0.29±0.07 0.38±0.09t值 －4.583 7.917 －3.433 －4.616P值0.001 ＜0.001 0.009 0.001

3 討論

氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié)細胞功能及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。低水平的氧化應(yīng)激介導(dǎo)細胞的生長和細胞信號傳導(dǎo)〔5〕。但過高的氧化應(yīng)激水平又可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如肺氣腫。氧化劑對細胞信號傳導(dǎo)的影響主要位于含酪氨酸的受體和酶的轉(zhuǎn)錄后修飾水平，從而損害結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)和DNA，并最終誘發(fā)凋亡。研究顯示，凋亡細胞的氧化應(yīng)激水平增加〔6〕，與凋亡之間存在著惡性循環(huán)。

γ-GCS能被氧化劑、炎癥介質(zhì)、抗炎因子、抗腫瘤藥物、重金屬等激活，在調(diào)控內(nèi)源性抗氧化劑GSH的合成中扮演關(guān)鍵性的作用〔7〕。前期研究發(fā)現(xiàn):正常情況下，肝、肺以及腎組織均有一定量的γ-GCS基因表達;在肺氣腫狀態(tài)下，肺組織中γ-GCS的基因表達更為明顯〔2〕。本研究中發(fā)現(xiàn)骨骼肌、心肌中也有γ-GCS的表達，尤其是在肺氣腫狀態(tài)下，其表達明顯增加。γ-GCS表達增加是機體通過增強抗氧化能力，從而達到降低氧化性損傷的一種自我防護反應(yīng)〔8〕。本研究結(jié)果也證實，模型小鼠心肌γ-GCS含量較骨骼肌表達增多，而心肌凋亡程度卻較骨骼肌凋亡程度輕。因此，骨骼肌是較心肌更易受損傷的部位，可能是肺氣腫患者容易出現(xiàn)骨骼肌萎縮和功能紊亂的重要機制之一。

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〔2012-02-29收稿 2012-03-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

R56

A

1005-9202(2012)17-3721-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.049

汪金峰(1963-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)及呼吸病學(xué)研究。