任吉祥 林 雪任洪亮趙建軍 王 健 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

破血化瘀，填精補(bǔ)髓法對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及TrkB蛋白表達(dá)的影響

任吉祥 林 雪1任洪亮1趙建軍 王 健 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討破血化瘀，填精補(bǔ)髓法對(duì)腦出血大鼠血腫周圍組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用Wistar大鼠復(fù)制腦出血大鼠模型，觀察破血化瘀，填精補(bǔ)髓法方劑改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的情況及對(duì)血腫周圍組織BDNF及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果 在給藥第7天，與模型組比較，陽(yáng)性藥組、受試藥各劑量組均明顯增加了損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05);在給藥第3、7、14天，與模型組比較，受試藥高劑量和中劑量均明顯增加了損傷腦區(qū)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論 破血化瘀，填精補(bǔ)髓法方劑能明顯改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損;其作用機(jī)制可能與上調(diào)腦出血血腫周圍損傷組織中BDNF及受體TrkB蛋白表達(dá)有關(guān)。

腦出血;BDNF;TrkB;破血化瘀;填精補(bǔ)髓

腦損傷后的康復(fù)依靠腦的自身可塑性及功能重組，這些機(jī)制有多種表現(xiàn)方式，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的增殖、突觸功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的抑制等。近年來(lái)，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)在腦損傷修復(fù)中的作用已被肯定。國(guó)內(nèi)關(guān)于BDNF及TrkB的研究較多，但研究對(duì)象多缺血性腦梗死，有關(guān)中藥治療腦出血(ICH)的研究在國(guó)內(nèi)并不多見。本研究觀察破血化瘀，填精補(bǔ)髓法中藥湯劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠BDNF及TrkB表達(dá)的影響，探討中藥干預(yù)對(duì)腦出血后顱腦損傷的修復(fù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～300 g，由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供，大鼠許可證號(hào):SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀，填精補(bǔ)髓法實(shí)驗(yàn)方劑:(水蛭8 g、生大黃10 g、生蒲黃 15 g、虻蟲 5 g、瓜蔞 20 g、三七 10 g、石菖蒲 15 g、龜板膠10 g)，采用傳統(tǒng)煎藥方法，去渣后取藥液進(jìn)行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存?zhèn)溆?。醒腦健神膠囊(批號(hào):921116，吉林省中醫(yī)院制劑室)。BDNF及TrkB免疫組化試劑盒采用中杉金橋通用型二步法檢測(cè)試劑盒(Pv6000)。大鼠腦立體定位儀(美國(guó)STOELTING公司);手持式牙科鉆(上海齒科器械廠);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電有限公司);RM2235型組織切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 150只Wistar大鼠隨機(jī)分成7組:正常對(duì)照組6只;假手術(shù)組，模型組，受試藥高、中、低劑量組，陽(yáng)性藥對(duì)照組每組24只。又分為 1、3、7、14 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每時(shí)間點(diǎn)6只。

1.2.2 模型制備 參照張朋奇等〔1〕方法制造實(shí)驗(yàn)性腦出血模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔麻醉，于大鼠腹側(cè)尾根部1.5 cm處縱行切開，游離尾動(dòng)脈，微量進(jìn)樣器抽取非肝素化尾動(dòng)脈血50 μl。調(diào)整腦立體定位儀，使大鼠俯臥位固定于立體定位儀，使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中線切開頭部皮膚暴露顱骨、前囟和冠狀縫。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為0點(diǎn)，于0點(diǎn)前0.4 mm、右側(cè)旁開3 mm處鉆孔，達(dá)硬腦膜表面。微量進(jìn)樣器垂直刺入顱骨外表面下6.0 mm處將50 μl動(dòng)脈血注入右側(cè)尾狀核。以10 μl/min的速度，5 min左右全部注入。留針30 min，緩慢出針1 mm，留針10 min，然后緩慢將針完全退出，骨蠟封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉并縫合。假手術(shù)組操作過程同上，但不向腦內(nèi)注血。

1.2.3 給藥方法 正常對(duì)照組:自由飲食飲水。假手術(shù)組:生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，1次/d;模型組。同假手術(shù)組。治療低劑量組:0.5 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;中劑量組:1 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;高劑量組:2 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d。陽(yáng)性藥對(duì)照組:予醒腦健神膠囊30 mg/100 g體重，溶于2 ml水灌胃，1 次/d。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 采用Longa評(píng)分法。0分:沒有神經(jīng)功能缺損;1分:左側(cè)前爪不能完全伸展;2分:行走時(shí)，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒;4分:不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)BDNF及TrkB蛋白表達(dá)水平 大鼠以水合氯醛麻醉后，切開胸腔，剝離心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈和胸主動(dòng)脈，剪開右心耳，靜脈留置針刺進(jìn)左心室，用0.9%生理鹽水進(jìn)行灌注，待流出清澈生理鹽水后，改用10%多聚甲醛灌注，待大鼠頸部及上肢僵硬后，斷頭取腦，腦組織沿針道前后5 mm切開，取中段部分。組織固定，梯度脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片。進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。根據(jù)Pv6000說(shuō)明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組指標(biāo)以±s表示，組間相差顯著性采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BDNF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在給藥第1、3天，與假手術(shù)組比較，模型組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，陽(yáng)性藥醒腦健神膠囊對(duì)損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性增加腦損傷時(shí)腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步分析表明受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01，P＜0.05)。在給藥第7天，與模型組比較，陽(yáng)性藥醒腦健神膠囊也明顯增加損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01)，受試藥高劑量、中劑量和低劑量均明顯增加了損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。在給藥第14天，與假手術(shù)組比較，模型組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞明顯增高(P＜0.05)，但與第7天比較，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞明顯降低;與模型組比較，陽(yáng)性藥醒腦健神膠囊對(duì)損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性地增加了腦損傷時(shí)腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步分析表明受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01，P＜0.05)，而低劑量組并沒有看到相同的效應(yīng)。見圖1。

圖1 各組大鼠1、3、7、14 d BDNF細(xì)胞數(shù)目比較

2.2 TrkB免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 給藥第1天，與假手術(shù)組比較，模型組TrkB陽(yáng)性細(xì)胞明顯增高(P＜0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥醒腦健神膠囊對(duì)損傷腦區(qū)TRKB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性增加腦損傷時(shí)腦區(qū)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量;進(jìn)一步分析表明，只有受試藥高劑量組明顯增加了損傷腦區(qū)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)。在給藥第3、7、14天，與模型組比較，陽(yáng)性藥醒腦健神膠囊對(duì)損傷腦區(qū)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量仍沒有明顯的影響(P＞0.05);受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區(qū)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠1、3、7、14 d，TrkB細(xì)胞數(shù)目比較

3 討論

BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有不可替代的作用，能通過多種途徑調(diào)控不同種類神經(jīng)元的生存、發(fā)育、分化，維持神經(jīng)突觸傳遞〔3〕，調(diào)控神經(jīng)元損傷后的存活、修復(fù)及細(xì)胞退行性變等，甚至在細(xì)胞凋亡過程中也起著關(guān)鍵作用〔4〕。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過與其特異性TrkB中的全長(zhǎng)型受體結(jié)合，激活胞內(nèi)的酪氨酸激酶活性，引導(dǎo)TrkB的自身磷酸化，激活鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酸肌醇-3-激酶(PI3K)三條途徑，并最終激活 cAMT反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，起到抵抗自由基、拮抗氨基酸神經(jīng)毒性、平衡細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔5〕、促進(jìn)血管內(nèi)皮新生〔6〕等作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組大鼠在腦出血后，通過應(yīng)用破血化瘀，填精補(bǔ)髓法中藥干預(yù)，其神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)可有明顯改善;3 d后，高、中劑量組各種相關(guān)癥狀即可消失。破血化瘀，填精補(bǔ)髓法各組與模型組比較，BDNF的表達(dá)在第7天達(dá)高峰，14 d可恢復(fù)到基本水平。重復(fù)的單因素方差分析顯示，高劑量組效果最顯著;其對(duì)TrkB表達(dá)的促進(jìn)作用，可在第7天達(dá)峰，持續(xù)到第14天，并與其藥物劑量呈正相關(guān)。

總之，運(yùn)用破血化瘀，填精補(bǔ)髓法中藥湯劑治療腦出血大鼠可明顯減輕神經(jīng)功能缺損的癥狀，其機(jī)制可能與破血化瘀，填精補(bǔ)髓法中藥湯劑顯著促進(jìn)BDNF及TrkB表達(dá)，啟動(dòng)BDNF-TrkB通路達(dá)到神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)作用有關(guān)。

1 張朋奇，朱賢立，趙甲山，等.一種大鼠腦內(nèi)出血模型的建立與評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2005;10(1):33-5.

2 諸葛啟釧譯.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:17-25.

3 Takei N，Nawa H.Regulation of brain function by neurotrophin〔J〕.Chemistry，2007;76(1):111-23.

4 侯莉娟，喬德才.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的研究現(xiàn)狀〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2005;20(12):940-2.

5 劉 芳，張偉玲，鄒 偉，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)急性神經(jīng)損傷保護(hù)作用機(jī)制初探〔J〕.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2006;26(10):687-8.

6 王雅丹，胡 豫，孫春艷.Akt、ERK1/2活化在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促血管新生中的作用〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2007;23(5):833-8.

〔2012-01-17收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 袁左鳴)

R743

A

1005-9202(2012)17-3719-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.048

1 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)

王 健(1970-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病研究。

任吉祥(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病研究。