關洪全 高 原 王素娟 王 哲 馬賢德 趙金茹 王守巖 柴繼嚴 王 健

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點海馬組織TNF-α表達的影響

關洪全 高 原 王素娟 王 哲 馬賢德 趙金茹 王守巖 柴繼嚴 王 健

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

目的 觀察眼針對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白表達的影響，以探討眼針對缺血再灌注大鼠腦海馬區(qū)細胞的保護作用及其作用機制。方法 健康SD大鼠，雌雄不拘，設正常對照組、假手術組、模型組、眼針組;采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，選取眼穴肝區(qū)、腎區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)，平刺，進針3 mm，留針20 min;分別于腦缺血再灌注后3、24、72 h處死動物并取材;應用蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)檢測海馬組織中TNF-α蛋白的表達。結(jié)果 眼針組海馬組織TNF-α在腦缺血再灌注后3、24、72 h均較模型組明顯降低，差異顯著。結(jié)論 眼針療法可以降低腦缺血再灌注模型大鼠海馬組織TNF-α的表達，進而抑制由腦缺血再灌注誘導的炎癥反應，發(fā)揮腦保護作用。

眼針;缺血再灌注;腫瘤壞死因子-α;海馬

眼針療法是遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院彭靜山老先生發(fā)明的一種針刺療法，臨床應用多年，對缺血性腦卒中等疾病具有很好的療效，但其機制尚未闡明。腦缺血再灌注損傷主要與氧化應激反應、炎性反應、鈣超載、腦水腫和細胞凋亡等有關。炎性反應在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有廣泛生物學功能的炎癥介質(zhì)，在腦組織缺血再灌注后引起的炎癥反應、細胞凋亡等組織損傷中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。本研究通過觀察眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦海馬組織勻漿中TNF-α蛋白表達的影響，探討其腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康SD大鼠96只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實驗動物中心提供。實驗前適應性喂養(yǎng)1 w，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。將大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組、眼針組，再根據(jù)缺血再灌注損傷時間分設3 h、24 h、72 h亞組，每亞組8只。

1.2 模型制備與評價 模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，模型制作按照文獻〔4〕記載方法進行。模型成功標準:大鼠于缺血2 h后進行再灌注，再灌注后進行神經(jīng)功能缺損評分，參照Longa 5分制評分標準〔5〕:0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術組術式同模型組、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1 cm，其他同手術組。正常組未處理。

1.3 眼針取穴及刺法 眼針組:用31號13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法〔6〕，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法:平刺，進針3 mm。留針10 min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時間:3 h針刺組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30 min，分別進行眼針治療;24 h、72 h針刺組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30 min分別進行眼針治療，除此之外每12 h針刺1次。見圖1。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

1.4 試劑及實驗用藥 親和純化兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 檢測方法 海馬組織TNF-α蛋白表達(Western印跡法)檢測:分別于缺血再灌注損傷3 h、24 h、72 h給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側(cè)海馬，按海馬組織凈重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相應體積的裂解液，pH7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。兔抗鼠TNF-α 一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 顯色;掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，采用方差分析進行比較。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等;假手術組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。與模型組比較，眼針組再灌注損傷3 h、24 h、72 h后神經(jīng)功能缺損評分均有差異(P＜0.01)。見表1。

表1 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s，n=8)

表1 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別3 h 24 h 72 h模型組2.625±0.916 1 3.125±0.640 9 2.625±0.744 0眼針組 1.500±0.534 51)1.500±0.534 51)1.625±0.517 51)

2.2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點海馬組織TNF-α蛋白表達的影響 采用Western印跡方法檢測大鼠右側(cè)海馬TNF-α蛋白，以β-αctin為內(nèi)參，模型組TNF-α蛋白表達強度明顯強于正常組和假手術組，眼針組表達明顯低于模型組，均有顯著差異(P＜0.05)。見圖2、表2。

表2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點海馬組織TNF-α蛋白表達的影響(±s，n=8)

表2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點海馬組織TNF-α蛋白表達的影響(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別3 h 24 h 72 h正常組0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3假手術組 0.694 5±0.083 8 0.686 3±0.030 0 0.616 7±0.042 6模型組 1.039 4±0.065 71)1.086 8±0.037 61)1.120 8±0.040 01)眼針組 0.843 2±0.052 92)0.766 9±0.035 22)0.711 9±0.032 72)

圖2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點海馬TNF-α蛋白表達的影響

3 討論

TNF-α是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子，參與機體免疫應答和炎癥反應。研究表明，有許多種促炎細胞因子在腦缺血損傷后高度表達，TNF-α是較早釋放的具有多種生物效應的重要促炎細胞因子，在炎癥反應過程中發(fā)揮級聯(lián)放大反應的作用，可以激活細胞因子誘導白介素和次級炎癥介質(zhì)的合成。腦缺血再灌注后，TNF-α在損傷區(qū)域大量表達，除循環(huán)性巨噬細胞外，缺血神經(jīng)組織內(nèi)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞亦是TNF-α的重要來源，TNF-α在腦組織中高表達具有神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)細胞的死亡〔7〕。

本實驗結(jié)果顯示，正常組和假手術組大鼠海馬組織僅見少量TNF-α表達，說明TNF-α在正常海馬組織中低含量存在，可能與神經(jīng)細胞的正常維護有關。模型組大鼠海馬組織TNF-α蛋白表達在缺血再灌注3 h開始升高，隨著缺血再灌注時間的延長，24 h明顯升高，72 h升高達高峰，表明腦缺血再灌注后72 h內(nèi)，缺血海馬組織的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α隨著時間的延長而逐漸增多，導致海馬組織的缺血性損傷，且TNF-α的表達與海馬組織的損傷程度呈正相關。給予眼針治療后，大鼠海馬組織TNF-α蛋白表達明顯下降，說明眼針在海馬組織缺血再灌注中能夠抑制TNF-α的表達，減輕其對腦組織的損傷。

眼針是在眼眶周圍針刺以治療全身疾病的一種微針技術，是針灸施術的一種特殊針法。中醫(yī)認為，腦為奇恒之府，腦由髓匯集而成，故名“髓海”，腦是精髓和神明高度匯集之處，有元神之府。眼與腦密切相連?！啃晤愅瑁瓋?nèi)有大絡六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一;中絡八，謂膽、胃，大小腸，三焦、膀胱各主其一;外有旁支細絡莫知其數(shù)，皆懸貫于腦……〔8〕。說明眼通過經(jīng)絡與腦密切相連。“五臟六腑之精氣，皆上注于目，而為之晴。精之窠為眼……其窠氣之精為白眼，肌肉之精為約束。裹擷筋骨血氣之精，而與脈并為系，上屬于腦，后出于項中，故邪入于項，因逢其身之虛，其入深，則隨目系以入腦”〔9〕?！鞍死獞醢素裕}絡經(jīng)緯于腦，貫通臟腑，以達血氣，往來以滋于目”。說明眼與腦通過經(jīng)絡密切相連，生理上相互協(xié)調(diào)，病理上也是病邪傳變的途徑。中醫(yī)學認為，缺血性中風是由于年老體虛，臟腑功能減退，氣血運行不暢，淤血阻滯腦部絡脈所致。刺針眼穴肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，具有醒神開竅、活血通絡作用。本實驗證明，針刺上述穴位可通過直接抑制缺血性腦損傷大鼠海馬組織TNF-α蛋白的表達來實現(xiàn)對腦細胞損傷的保護作用。

1 丁德光，李家康，羅惠平，等.電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)TNF-α mRNΑ 表達及TNF-α 含量影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2007;16(6):695-7.

2 Rodríguez-Yáňez M，Castillo J.Role of inflammatory markers in brain ischemia〔J〕.CurrOp in Neurol，2008;21(3):353-7.

3 Schaller B，Graf R.Cerebral ischemia and reperfusion:the pathophysiologic concept αs α basis for clinical therapy〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2004;24(2):351-71.

4 馬賢德，孫宏偉.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學刊，2009;27(6):1200-1.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

6 彭靜山.眼針療法〔M〕.沈陽:遼寧科學技術出版社，1990:11.

7 李丹萍，易 莉，陳 強，等.針刺對腦缺血損傷級聯(lián)反應和再灌注影響的研究進展〔J〕.中國康復醫(yī)學雜志，2005;20(11):865-7.

8 王肯堂.證治準繩〔M〕.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:226.

9 程士德.內(nèi)經(jīng)講義·靈樞·大惑論〔M〕.上海:上海科技出版社，1984:56.

〔2011-03-17收稿 2011-06-15修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)

The effect of eye acupuncture therapy on the expression of TNF-α of hippocampus at different time points in rats with cerebral ischemia reperfusion

GUAN Hong-Quan，GAO Yuan，WANG Su-Juan，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

Objective To investigate TNF-α expression at different time points in the brain of rats with cerebral ischemia-reperfusion(IR)injury，in order to discuss the mechanism of eye-acupuncture therapy and observe the intervention effects on the hippocampus.Methods Healthy SD rats，male and female，were randomly divided into normal，sham-operated control，model and eye-acupuncture groups.Sham-operated control，model and eye-acupuncture groups were divided into 3，24 and 72 h subgroups.The rat model of cerebral IR was established by suture method.Eye acupoint liver area，kidney area，upper jiao area and lower jiao area were selected and acupunctured horizontally，inserting needle in 3 mm deep，retaining needle for 20 min.All the animals were executed respectively at 3，24，72 h after reperfusion and draw materials.The method of immunohistochemistry and Western blot technology were taken to detect the changes of hippocampus TNF-α expression in rats after the eye-acupuncture therapy.Results Compared with that of model group，TNF-α expression in the hippocampus of rats of the eye-acupuncture group was significantly decreased obviously at 3，24，72 h after reperfusion.Conclusions The eye-acupuncture therapy could down-regulate hippocampus TNF-α expression in rats with cerebral IR injury，suppress inflammatory response induced by cerebral IR and play a role in protecting brain.

Eye acupuncture;Ischemia-reperfusion;Tumor necrosis factor-α;Hippocampus

R74

A

1005-9202(2012)17-3705-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.043

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(No.2007CB512702)

王 健(1948-)，男，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管病研究。

關洪全(1954-)，男，教授，主要從事中醫(yī)藥對免疫的調(diào)控研究。