馬小剛 霍華治 蘇春永 王 超(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 05600)

異丙酚對急性肺栓塞大鼠炎性因子表達的影響

馬小剛 霍華治 蘇春永 王 超1(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 觀察異丙酚對急性肺栓塞(PTE)大鼠炎性因子的影響。方法 大鼠分為假手術(shù)組、模型組、異丙酚低、中、高劑量(4，8，16 mg/kg)組。制備急性自體血栓PTE模型。進行血氣分析;檢測肺系數(shù)、濕/干重(W/D);放射免疫法檢測血液中內(nèi)皮素(ET)-1、血栓素B2(TXB2)含量;RT-PCR檢測肺組織白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的表達;Western印跡方法檢測IL-1、IL-6、TNF-α蛋白的表達。結(jié)果 異丙酚能顯著升高PO2、PCO2水平，降低肺系數(shù)、濕/干重、ET-1、TXB2含量，降低IL-1、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白表達(P＜0.05)。結(jié)論 異丙酚能抑制炎性因子的表達，對PTE大鼠起保護作用。

異丙酚;肺栓塞;炎性因子

肺血栓栓塞癥(PTE)以肺循環(huán)和呼吸功能障礙為主要的臨床和病理生理特征。研究PTE中炎癥因子的表達及相互關(guān)系，對更好地了解PTE發(fā)生機制及藥物干預是非常重要的。異丙酚是一種較新型的靜脈麻醉藥物，在發(fā)揮麻醉效應的同時，因其靜脈輸入，可對全身組織產(chǎn)生不同的影響〔1〕。我們前期研究結(jié)果顯示異丙酚對PTE大鼠有保護作用〔2〕，在此基礎(chǔ)上，我們觀察大鼠PTE后炎癥因子白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)表達的情況，并進一步探討異丙酚對PTE大鼠炎癥因子的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠，清潔級，雄性，280～300 g，由河北省實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 異丙酚由四川蜀樂藥業(yè)股份有限公司提供;內(nèi)皮素-1(ET-1)和血栓素-2(TXA2)試劑盒購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技丌發(fā)中心放免研究所;IL-1、IL-6、TNF-α引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，一抗購自Santa Cruz公司。

1.3 大鼠PTE模型建立 大鼠尾靜脈取血0.2 ml，收集入無菌試管內(nèi)，37℃水浴箱內(nèi)過夜，第2天分割成5 mm×1 mm的栓子，放入2 ml的注射器內(nèi)備用。大鼠用20%名烏拉坦麻醉，頸化中切開，分離右側(cè)頸總靜脈，采用導管方法將混有15個血栓的2 ml生理鹽水注入靜脈。注入血栓后可見大鼠明顯發(fā)紺，呼吸加快。

1.4 動物分組與給藥 SD大鼠，40只，隨機分為假手術(shù)組(Ⅰ)、模型組(Ⅱ)、異丙酚低劑量(Ⅲ):4 mg·kg－1·h－1、異丙酚中劑量(Ⅳ):8 mg·kg－1·h－1、異丙酚高劑量組(Ⅴ):16 mg·kg－1·h－1。每組8只動物。Ⅱ ～Ⅴ組注入栓子后，Ⅲ～V組分別繼續(xù)輸注異丙酚(用5%葡萄糖稀釋)4 h，Ⅱ組繼續(xù)輸注5%葡萄糖2 ml/h。Ⅰ組頸靜脈輸注生理鹽水。輸注異丙酚4 h時，腹主動脈取血處死動物。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 血氣分析 各組實驗動物于栓塞前、栓塞后、輸注異丙酚后，分離頸總動脈，取血作血氣分析。

1.5.2 肺系數(shù)及濕/干重(W/D)測定 仔細切除肺外支氣管和脂肪組織，稱肺重，計算肺系數(shù)=肺重/體重。取右側(cè)肺稱重，置烘箱烘成恒重后，再次稱重，進行W/D計算。

1.5.3 ET-1和TXB2含量測定 取全血，按試劑盒的要求及步驟采用放射免疫法測定。

1.5.4 RT-PCR方法檢測大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達 取肺組織，常規(guī)方法提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應，引物序列:IL-1上游引物:5'-TGTGACTCGTGGGATGATGAC-3'， 下 游 引 物:5'-CCCGACCATTGCTGTTTCCT-3'，長度 460 bp。IL-6上游引物:5'-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3'，下游引物:5'-CCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC-3'，長 度 525 bp。TNF-α 上 游 引 物:5'-CCACCACGCTCTTCTGTCTA-3'，下游引物:5'-GGCAGCCTTGTCCCTTGAA-3'，長度315 bp。內(nèi)參照β-actin上游引物:5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游引物:5‘-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，長度500 bp。

PCR 反應條件為 95℃4 min，預變性后，95℃ 30 s，56℃40 s，72℃ 30 s，25 個循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。以各目的基因片段密度值/內(nèi)參照密度值的比值進行比較。

1.5.5 Western印跡法檢測大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達 取肺組織，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，用一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗三次后加二抗 HRP(辣根過氧化酶)-IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。β-actin作為內(nèi)參照。用各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進行比較。

2 結(jié)果

2.1 血氣分析 栓塞后，Ⅱ～Ⅴ組血氧分壓(PO2)和血二氧化碳分壓(PCO2)明顯下降，與Ⅰ組比較差異有顯著性(P＜0.05)。與Ⅱ組比較，Ⅲ～Ⅴ組治療后PO2和PCO2均顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 異丙酚對急性肺栓塞大鼠PO2和PCO2的影響(mmHg，±s，n=8)

與Ⅱ組比較:1)P＜0.05;與Ⅰ組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 PO2栓塞前 栓塞/假手術(shù)后 治療后PCO2栓塞前 栓塞/假手術(shù)后 治療后Ⅰ組 96.34±8.38 95.08±9.041)96.16±9.151)40.76±4.65 42.09±5.121)41.15±5.451)Ⅱ組 95.87±9.25 63.38±8.282)65.29±8.282)41.08±4.38 31.28±4.962)32.63±4.442)Ⅲ組 96.33±8.91 64.89±7.762)76.38±8.731)2)42.33±5.21 30.76±4.072)38.13±4.421)Ⅳ組 95.91±8.03 66.06±8.942)77.03±9.431)2)41.59±4.55 32.71±4.612)38.29±4.231)Ⅴ組 97.24±9.08 65.98±8.532)83.53±9.681)2)40.87±5.09 31.14±4.732)39.17±4.751)

2.2 大鼠肺系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量的變化 與Ⅰ組比較，Ⅱ組大鼠腫系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量均明顯升高(P＜0.05)，與Ⅱ組比較，Ⅲ ～V 組肺系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量均顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 異丙酚對急性肺栓塞大鼠肺系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量的影響(±s，n=8)

表2 異丙酚對急性肺栓塞大鼠肺系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量的影響(±s，n=8)

組別 肺系數(shù) W/D ET-1(pg/L) TXB2(pg/L)Ⅰ組 0.45±0.041)4.21±0.811)43.46±5.831)252.11±30.811)Ⅱ組 0.54±0.042)7.14±1.572)60.59±9.652)334.92±33.832)Ⅲ組 0.48±0.051)5.63±1.231)2)48.97±8.401)296.73±21.791)2)Ⅳ組 0.48±0.051)5.36±1.251)2)47.15±8.551)285.10±20.081)2)Ⅴ組 0.46±0.061)5.25±1.241)2)46.15±6.701)282.17±27.151)2)

2.3 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達的變化 RT-PCR結(jié)果顯示與Ⅰ組比較，Ⅱ組IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達顯著升高(P＜0.05)，與Ⅱ組比較，Ⅲ ～V 組 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達顯著下降(P＜0.05)。見表3。

表3 異丙酚對大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響(±s，n=8)

表3 異丙酚對大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響(±s，n=8)

組別 IL-1 IL-6 TNF-αⅠ組 0.16±0.021)0.17±0.031)0.15±0.031)Ⅱ組 1.48±0.102)1.35±0.082)1.36±0.102)Ⅲ組 0.86±0.051)2)0.83±0.061)2)0.92±0.071)2)Ⅳ組 0.70±0.051)2)0.64±0.051)2)0.67±0.051)2)Ⅴ組 0.40±0.041)2)0.43±0.041)2)0.41±0.051)2)

2.4 IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達的變化 結(jié)果與Ⅰ組比較，Ⅱ組IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，與Ⅱ組比較，Ⅲ ～V 組 IL-1、IL-6、TNF-α 蛋白表達顯著下降(P＜0.05)，與RT-PCR結(jié)果一致。見表4。

表4 異丙酚對大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達的影響(±s，n=8)

表4 異丙酚對大鼠肺組織IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達的影響(±s，n=8)

組別 IL-1 IL-6 TNF-αⅠ組 0.17±0.051)0.15±0.031)0.17±0.021)Ⅱ組 1.42±0.162)0.80±0.102)1.02±0.142)Ⅲ組 0.89±0.111)2)0.63±0.091)2)0.68±0.081)2)Ⅳ組 0.55±0.071)2)0.45±0.061)2)0.50±0.071)2)Ⅴ組 0.41±0.051)2)0.25±0.031)2)0.27±0.041)2)

3 討論

尋找有效的治療藥物一直是肺栓塞研究的熱點，且其具體發(fā)病機制仍需進一步探討。異丙酚是一種靜脈麻醉藥物，已有研究表明異丙酚對急性肺損傷、PTE均有保護作用，但異丙酚在急性自體血栓肺栓塞中的作用研究尚不多見。本實驗提示異丙酚對PTE大鼠有保護作用。

近年來炎癥反應與血栓形成的關(guān)系逐漸引起有關(guān)學者的重視〔3〕，研究認為肺血栓栓塞后啟動復雜的炎癥反應介導凝聚級聯(lián)反應，受損的血管細胞和激活的局部炎癥細胞(白細胞、單核/巨噬細胞等)可釋放一系列的細胞因子如TNF-α、白介素(IL-1、IL-6等)及其他炎癥因子〔4〕。此外，在血凝級聯(lián)反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用的凝血酶亦可激活內(nèi)皮細胞、單核細胞、中性粒細胞等表達黏附分子，釋放炎性介質(zhì)。通過上述途徑釋放的細胞因子尤其是TNF-α、IL-1、IL-6和其他的炎性介質(zhì)引起肺泡毛細血管滲透性升高，造成間質(zhì)液體聚集和肺水腫，導致肺實質(zhì)氣體交換減少，最終致低氧血癥。本實驗結(jié)果提示PTE后促炎性細胞因子被大量產(chǎn)生，參與了PTE后的病變過程。給予異丙酚處理后能顯著抑制肺組織中IL-1、IL-6、TNF-α表達，使炎癥反應減弱，改善低氧血癥。

另一方面，TNF-α等炎性因子亦可以影響血管舒縮活性物質(zhì)的表達，Zemel等〔5〕報道了 TNF-α 能引起 TXB2、ET 等縮血管物質(zhì)的物質(zhì)的產(chǎn)生增加，引發(fā)血管收縮和舒張功能障礙。肺栓塞后動/靜脈血漿ET放免活性比值升高，代謝異常，ET-1的增高又可引起肺血管、支氣管痙攣和毛細血管通透性增加〔6〕，而在肺栓塞早期，TXA2可介導多形核白細胞與肺毛細血管及動脈內(nèi)皮細胞的黏附，促進炎癥形成，使大量炎性因子表達增加。本研究結(jié)果顯示異丙酚能明顯降低栓塞大鼠的肺系數(shù)、W/D、ET-1、TXB2含量，抑制炎性因子的表達，降低了PTE病變程度。

1 Vasileiou I，Xanthos T，Koudouna E，et al.Propofol:a review of its nonanaesthetic effects〔J〕.Eur J Pharmacol，2009;605(1-3):1-8.

2 霍華治，蘇春勇，馬小剛.異丙酚對大鼠急性自體血栓肺栓塞的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(9):1257-9.

3 Bu DX.Griffin G，Lichtman AH.Mechanisms for the anti-inflammatory effects of statins〔J〕.Curr Opin Lipid，2011;22-(3):165-70.

4 Li J，Li J，Zhang L，et al.Penehyclidine prevents nuclear factor-kappaB activation in acute lung injury induced by lipopolysaccharide〔J〕.J Pharm Pharmacol，2008;60(9):1197-205.

5 Zemel D，Koomen GC，Hart AA，et al.Relationship of TNF-alpha，interleukin-6，and prostaglandins to peritoneal permeability for macromolecules during longitudinal follow-up of peritonitis in continuous ambulatory peritoneal dialysis〔J〕.J Lab Clin Med，1993;122(6):686-96.

6 Sofia M，Stanislaao F，Marco A.et al.Endothelin abnormalities in patients with pulmonary embolism〔J〕.Chest，1997;111(3):544-9.

〔2011-03-30收稿 2011-03-27修回〕

(編輯 曹夢園)

Effects of propofol on expression of inflammatory factor in acute autoblood pulmonary thromboembolism of rats

MA Xiao-Gang，HUO Hua-Zhi，SU Chun-Yong，et al.
Handan Center Hospital，Handan 056001，Hebei，China

Objective To investigate the effects of propofol on inflammatory factors expressions in acute pulmonary thromboembolism(PTE)of rats.Methods Rats were randomly divided into sham，model and propofol groups(4，8，16 mg/kg).Rat PTE model was established by intravenous injection of auto-blood clots.The PO2and PCO2in arterial blood were measured.The coefficient and wet/dry weight(W/D)of lung were detected.The concentrations of ET-1 and TXB2 in plasma were examined by radio-immunity technique.The mRNA expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α in lung tissue were assessed by RT-PCR.The protein expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α in lung tissue were assessed by Western blot.Results The PO2，PCO2in arterial blood were significantly increased，while the coefficient，W/D of lung，the contents of ET-1 and TXB2，the expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α were significantly decreased after administration with propofol.Conclusions Propofol could inhibit the expressions of inflammation factors and protect PTE rats.

Propofol;Pulmonary thromboembolism;Inflammatory factor

R563.5

A

1005-9202(2012)17-3696-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.039

河北省自然科學基金資助項目(C2011307008)

1 河北省人民醫(yī)院

王 超(1975-)，男，博士，主要從事老年病學研究。

馬小剛(1975-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸外科疾病研究。