呂春旭，陳曉霞，張 瑾，孫欽峰

(山東大學口腔醫(yī)院牙周科，山東省口腔生物醫(yī)學重點實驗室，山東濟南250012)

牙周病是一種慢性感染性疾病，是成年人牙齒喪失的首要原因［1］。牙周治療的最終目的是實現(xiàn)牙周組織的完全功能性再生，但傳統(tǒng)的治療方法和引導組織再生技術(shù)尚不能完全達到該目的。隨著組織工程學理論和技術(shù)的發(fā)展，牙周組織工程的研究也在不斷深入，目前其研究熱點主要集中在尋找高效的生長因子、理想的種子細胞和具有良好生物相容性的支架材料上［2］。特殊富含AT序列結(jié)合蛋白(special AT－rich sequence binding protein，SATB)－2是一種核基質(zhì)蛋白，在顱面部的發(fā)育和成骨細胞的分化中起關(guān)鍵性作用，可通過招募其他轉(zhuǎn)錄因子，直接或間接地調(diào)控主要骨基因的表達［3－4］。最近研究發(fā)現(xiàn)，Satb2 在牙胚中也有表達［5］，提示Satb2在牙及牙周組織發(fā)育中起著一定作用。核心結(jié)合因子 α1(core binding factor α1，CBFα1)是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細胞分化的關(guān)鍵因子，Cbfα1－/－基因敲除小鼠表現(xiàn)為完全的骨組織喪失和牙胚發(fā)育阻滯［6］，表明Cbfα1對于骨誘導及牙周組織的發(fā)育是必不可少的。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblast cells，HGFs)具有取材方便、容易培養(yǎng)的特點，并且在某些因子的誘導下表現(xiàn)出成骨特性［7－8］，使得 HGFs有望成為牙周組織工程的種子細胞。而Satb2和Cbfα1基因在HGFs中的表達情況目前尚未有報道。本研究通過組織塊法培養(yǎng)HGFs，采用 RT－PCR和Western blot方法研究 HGFs中 hSatb2、hCbfα1 的表達，為進一步研究Satb2和Cbfα1基因在牙周組織再生中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α－MEM、DMEM 培養(yǎng)液(Hyclone，美國);胰蛋白酶(Sigma，美國 );青霉素、鏈霉素(penicillium，streptomycine);胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Gibco，美國);TRIZOL(invitrogen公司);PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser(寶生物有限公司);2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克生物技術(shù)有限公司);BCA蛋白檢測試劑盒(凱基生物有限公司);蛋白質(zhì)相對分子量Marker、6×SDS上樣緩沖液(fermentas，美國);PVDF膜 (millipore，美國);HERA cell恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德國);Multiskan MK3型酶標儀(Thermo Labsystems公司，芬蘭);IXZ－ILL100型倒置相差顯微鏡(OLMPUS公司，日本);TGL－16G型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);Gene Quant pro紫外/可見光分光光度儀(Biochrom，美國);梯度PCR儀(Biometra，德國);Biofuge Stratos臺式冷凍高速離心機(Heraeus公司，德國);蛋白垂直平板型電泳槽、電泳儀、水平電泳槽、PAC－300型電泳儀(BIO－RAD科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 人牙齦成纖維細胞(HGFs)原代培養(yǎng)和傳代

收集18～30歲患者因手術(shù)而切除的健康牙齦組織，用含50 g/L青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗后，剪除上皮層，將余留的結(jié)締組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，鋪于培養(yǎng)瓶底，在50 mL/L CO2、37℃ 標準環(huán)境下倒置培養(yǎng)2 h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細胞游出情況。當細胞從組織塊邊緣爬出并長滿瓶底80% ～90%時，胰蛋白酶2.5 g/L+1 g/L EDTA消化傳代，取3～6代細胞用于后續(xù)試驗。

1.2.2 HGFs形態(tài)學觀察

取生長良好的第4代HGFs胰蛋白酶消化后，以2×105的細胞密度接種于預(yù)置有無菌蓋玻片的培養(yǎng)皿(36 mm×36 mm)中，標準環(huán)境下進行培養(yǎng)。待細胞生長成單層時，取出蓋玻片，PBS反復(fù)浸洗，950 mL/L乙醇固定，蘇木精染色5 min;自來水浸洗，稀鹽酸乙醇液分色(數(shù)秒即可);自來水再浸洗，用淡氨水使細胞核藍化3 min;自來水浸洗，伊紅染液5 min;自來水浸洗，依次浸入梯度乙醇各1 min;二甲苯透明3次，每次1 min，樹膠封片，鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 MTT法檢測細胞生長情況

取生長良好的第4代HGFs，以5×103/孔的細胞密度接種于96孔板，同時每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)液標準環(huán)境下進行培養(yǎng)。分別于細胞貼壁生長后1、2、3、4、5、6、7 d 各取出一組細胞，每孔加MTT液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)4 h后終止培養(yǎng)，吸盡培養(yǎng)液，每孔加 150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解后，在酶標儀上測各孔492 nm波長吸光值(OD)，并繪制細胞生長曲線。

1.2.4 RT－PCR 檢測 HGFs中 hSatb2 和 hCbfα1 mRNA的表達

采用Trizol法提取細胞總RNA。按照takara公司PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)Genebank中hCbfα1和hSatb2的基因序列，采用primer premier 5.0計算機軟件設(shè)計引物，并由上海博尚生物公司合成(表1)。RT－PCR反應(yīng)條件參照2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒(全式金生物公司)說明書。反應(yīng)結(jié)束后，配制20 g/L瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物加入上樣孔中(此PCR產(chǎn)物含有染料，不用額外加Loading buffer)，同時在旁邊的孔中加入DNA Marker，然后在100 V電壓下進行電泳。當指示劑遷移至凝膠的2/3時，終止電泳，凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果并拍照。

表1 引物序列和長度

1.2.5 Western blot檢測 HGFs中 hSatb2 和hCbfα1 蛋白表達

采用Trizol法提取細胞蛋白，按照BCA蛋白測定試劑盒說明檢測蛋白濃度后，SDS－PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)，最后進行化學發(fā)光反應(yīng)，分析hSatb2和hCbfα1蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 HGFs的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

采用組織塊法培養(yǎng)HGFs，共培養(yǎng)10瓶，其中有7瓶在一周左右可見少量細胞從組織塊邊緣爬出，成功率為70%。生長出來的細胞呈貼壁生長，起初形態(tài)不規(guī)則多呈短梭型，也可見多邊形，菱形，細胞核呈圓形、橢圓形，位于胞體中央，核仁清晰，有1～4個。隨著傳代培養(yǎng)，細胞排列呈束狀、平行狀或雜亂無章，形態(tài)變成細長梭形，并有2～4個胞漿突。傳6代后細胞形態(tài)保持良好，與原代細胞相比形態(tài)更規(guī)則。HE染色可見細胞胞漿呈粉紅色，胞核呈藍色(圖1～3)。

圖1 HGFs原代細胞(×100)

圖2 第6代HGFs細胞(×100)

圖3 HE染色(×100)

2.2 細胞生長曲線

細胞生長曲線呈不規(guī)則的S型，開始前2 d細胞增殖緩慢，從第3天開始細胞增殖加快，到第5天細胞生長速度又變平緩(圖4)。

圖4 HGFs增殖情況

2.3 細胞hSatb2和hCbfα1 mRNA表達

RT－PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，hSatb2和 hCbfα1 mRNA在HGFs中均呈陽性表達(圖5)。

圖5 HGFs中 hsatb2、hcbfα1 mRNA 表達

2.4 細胞hSatb2和hCbfα1蛋白的表達

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，HGFs中有hSatb2蛋白表達，但未發(fā)現(xiàn)hCbfα1蛋白的表達(圖6)。

圖6 HGFs中hSatb2和hCbfα1蛋白表達

3 討論

HGFs來源于中胚層，是牙齦結(jié)締組織中的主要細胞類型，也是牙周組織中最豐富的細胞，具有活躍的自我更新能力，在牙周組織的形成、再生、保護、修復(fù)、維持完整性和功能的實施中起重要的作用［9］，本實驗采用原代組織塊法體外培養(yǎng)了HGFs，通過MTT法觀察細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)細胞在前2 d增殖比較緩慢，從第3天開始增殖加快，一直到第6天才減慢下來，細胞生長曲線近似“S”型。HGFs的體外培養(yǎng)由于來源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小且體外培養(yǎng)成活率高，因此HGFs的體外培養(yǎng)將有助于進行牙周組織再生工程的研究。

Satb2和Cbfα1作為成骨細胞分化和骨形成的重要調(diào)控因子，對骨的發(fā)育起重要作用。目前關(guān)于Satb2在牙周組織中表達情況的研究尚少，張瑾等［5］采用原位雜交的方法檢測了胚胎14.5 d時野生小鼠頭部Satb2的表達情況，發(fā)現(xiàn)Satb2在切牙牙胚的間充質(zhì)中高表達，在上皮成分中不表達，同時在發(fā)育的顎骨和下頜骨基質(zhì)中也有高水平表達，說明Satb2可能在頜骨和牙周組織發(fā)育過程中起重要作用。Cbfα1在牙囊和牙乳頭中也都有表達而且隨著牙齒的進一步發(fā)育和牙根、牙周組織的形成，Cbfα1 的表達更為明顯［10］，這說明 Cbfα1 可能參與牙周組織的發(fā)育。

本實驗采用RT－PCR及Western Blot方法分別檢測了Satb2和Cbfα1在HGFs中的表達情況，結(jié)果顯示，Satb2和Cbfα1在mRNA水平上都有表達，只是Cbfα1 mRNA的表達較Satb2弱;而在蛋白水平上，只檢測到了Satb2蛋白的表達。提示Satb2和Cbfα1可能在HGFs的骨向分化上作用程度不同，進一步研究Satb2和Cbfα1對HGFs生物學特性的影響，將有利于我們?yōu)檠乐芙M織工程尋找更佳的生長因子和種子細胞。

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