余正軍，劉慧平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

灰霉病是由灰葡萄孢菌［Botrytis cinerea Pers］引起的一種重要病害［1，2］，主要危害黃瓜、番茄、茄子、葡萄等作物。目前該病害仍以化學(xué)防治為主［3，4］，但因灰霉病菌具有繁殖速率高、遺傳變異大和適合度高等特性，長(zhǎng)期連續(xù)大量用藥使得該病菌對(duì)一些常用的內(nèi)吸性殺菌劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性［5］。目前主要以苯胺基嘧啶類殺菌劑（如嘧霉胺）防治灰霉病害［6］。嘧霉胺在山西省內(nèi)雖然沒有長(zhǎng)期大量連續(xù)使用，但據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)賈曉華等人的研究證明，江蘇省淮陰地區(qū)抗性頻率已經(jīng)達(dá)到了43.64%［7，8］；由于在山西省內(nèi)還沒有關(guān)于灰霉病菌對(duì)嘧霉胺抗藥性的監(jiān)測(cè)報(bào)道，作者于2010～2011年通過對(duì)采自山西省4個(gè)地區(qū)（晉南、晉中、晉東南、晉北）的灰霉病菌進(jìn)行了嘧霉胺抗性監(jiān)測(cè)，了解了灰霉病菌在山西省主要蔬菜種植區(qū)對(duì)嘧霉胺的抗性頻率和抗性水平，以期對(duì)生產(chǎn)上的合理用藥有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地區(qū)的劃分

由于每個(gè)地區(qū)的總體抗藥性水平各不相同，因此將山西省劃分為4個(gè)地區(qū)進(jìn)行調(diào)查：晉南地區(qū)（臨汾和運(yùn)城）、晉中地區(qū)（太谷、太原、榆次）、晉北地區(qū)（忻州和大同）、晉東南地區(qū)（長(zhǎng)治和晉城）；再在每個(gè)地區(qū)分四個(gè)不同區(qū)域，然后進(jìn)行廣泛的采樣。

1.2 菌株的采集

2010年8月～11月，在山西省晉南、晉中、晉北、晉東南4個(gè)地區(qū)保護(hù)地番茄、黃瓜上進(jìn)行隨機(jī)采樣，將采集的病果在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。分離時(shí)，將病果放在75%的酒精中，2min后挑取一小塊病組織轉(zhuǎn)接到PDA平板中進(jìn)行培養(yǎng)，2d后用顯微鏡鏡檢是否為灰霉病菌［9］，后轉(zhuǎn)接進(jìn)行純化保存。

1.3 供試殺菌劑

96.1%嘧霉胺原藥，由山東雙星農(nóng)藥廠提供。

1.4 含藥培養(yǎng)基的制備

96.1%嘧霉胺原藥用丙酮配成500mg·L－1的母液，然后把母液放在4℃的冰箱中貯藏。使用時(shí)以無菌水進(jìn)行稀釋，以10%藥液量加入融化的PDA培養(yǎng)基中（冷卻至45～50℃）充分搖勻，制成含最終所需藥量的PDA平板，用以進(jìn)行敏感性的測(cè)定。

1.5 灰霉菌株對(duì)嘧霉胺的敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行敏感性測(cè)定，將分離好的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，3d后，自菌落邊緣打取生長(zhǎng)活力一致、直徑為0.5cm菌塊。設(shè)定5個(gè)濃度梯度：0.25mg·L－1，0.50mg·L－1，1.00mg·L－1，5.00mg·L－1和10.00mg·L－1；每個(gè)處理重復(fù)3次，將母液（500mg·L－1）用無菌水稀釋到一定的比率加入到培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基冷卻后，將打取好的菌塊接種到含藥平板上，4d后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，由菌落直徑的平均值（cm）計(jì)算藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。根據(jù)所得的抑制率，用DPS軟件處理后得出EC50值。抗性水平依據(jù)紀(jì)明山文中所報(bào)道的敏感基線值（0.0911mg·L－1）進(jìn)行判別，抗性倍數(shù)小于5，屬于敏感菌株（S），在5～10之間為低抗菌株（LR），在10～40之間為中抗菌株（MR），大于40為高抗菌株（HR）［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性頻率及抗性水平測(cè)定結(jié)果

由表1可知，對(duì)山西省各個(gè)地區(qū)所采集的病果成功分離到169個(gè)灰霉菌株，其中晉南地區(qū)19個(gè)，晉中地區(qū)75個(gè)，晉東南地區(qū)24個(gè)，晉北地區(qū)51個(gè)。晉中、晉南、晉東南和晉北地區(qū)的灰霉菌對(duì)嘧霉胺的抗性頻率分別為60.0%、89.5%、25.0%和41.1%；晉南地區(qū)主要以高抗菌株為主，占57.9%；晉中地區(qū)主要以抗性菌株為主；而晉東南和晉北地區(qū)則主要以敏感菌株為主，分別占群體的75.0%和58.9%。

表1 山西省各地區(qū)灰霉菌對(duì)嘧霉胺的抗性頻率Table 1 Resistance frequencies of B.cinerea to pyrimethanil in various regions in Shanxi Province

2.2 嘧霉胺抗性菌株在山西各地區(qū)的分布（圖1）

由圖1可以看出，在晉北，晉中和晉東南地區(qū)灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的敏感菌株所占比例較高；而晉南地區(qū)最少，主要以高抗為主，表明晉南地區(qū)已經(jīng)產(chǎn)生了較高水平的抗性，繼續(xù)使用嘧霉胺已對(duì)其基本無效；在晉中地區(qū)主要以中抗菌株為主，表明在晉中地區(qū)已經(jīng)產(chǎn)生了中等抗性水平，應(yīng)注意合理或者輪換用藥；而在晉北和晉東南地區(qū)抗性水平還比較低。

圖1 嘧霉胺抗性頻率的地區(qū)分布／%Fig.1 Region distribution of resistance frequencies to pyrimethanil／%

3 結(jié)論與討論

所測(cè)山西省內(nèi)四個(gè)地區(qū)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有較高抗性水平的蔬菜灰霉病菌株，這可能是由于不合理用藥引起的，因此在這些地區(qū)，應(yīng)注意采取綜合防治，改變目前主要依靠化學(xué)手段防治的單一方法，走綜合治理的道路。就蔬菜灰霉病菌而言，應(yīng)以調(diào)節(jié)生態(tài)環(huán)境和生物防治為主，以化學(xué)防治為輔的綜合防治策略，以預(yù)防抗性的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)由于受到菌種采集地的單一性及其采集數(shù)量的影響，這并不能代表山西省內(nèi)蔬菜灰霉病菌抗藥性的全部情況，因?yàn)樵摼鷤鞑シ秶鷱V，繁殖能力強(qiáng)，因此山西省內(nèi)的情況有待進(jìn)一步全面跟蹤監(jiān)測(cè)。

［1］李寶篤，沈崇堯.植物病原真菌對(duì)殺菌劑的抗性及對(duì)策［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1994，24（3）：193－196.

［2］戴富明，周世明，陸金萍，等.上海郊區(qū)保護(hù)地主要蔬菜灰霉病菌抗藥性的初步研究［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1996，12（4）：73－76.

［3］A B Orth，M Rzhetskaya，E J Pell，et al.A serine（threonine）protein kinase confers fungicide resistance in the phytopathogenic fungus ustilago maydis［J］.Applied and environmental microbiology，1995，61（12）：2341－2345.

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［5］胡偉群，陳杰.灰霉病的化學(xué)防治進(jìn)展［J］.現(xiàn)代農(nóng)藥，2002（4）：8－11.

［6］杜會(huì)光，李春.棚室番茄灰霉病的發(fā)生與防治［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，11（2）：55－55.

［7］賈曉華.番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌對(duì)嘧霉胺的敏感性基線及番茄灰霉病菌抗藥性研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：38－46.

［8］紀(jì)明山，程根武，張益先，等.灰霉病菌對(duì)多菌靈和乙霉威抗性研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29（3）：213－216.

［9］高玉亮，李葵花.病原真菌單孢子顯微鏡下分離技巧［J］.植物保護(hù)，1999（6）：48.

［10］紀(jì)明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2003，30（4）：396－400.