郭瑩，李霞，秦艷杰

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

大瀧六線魚Hexagrammos otakii又名歐式六線魚，隸屬于鉳形目 Scorpaeniforms、六線魚科Hexagrammidae［1］，屬于冷溫性底層魚類，主要分布于中國(guó)山東和遼寧等地的近海多巖礁海區(qū)，日本、朝鮮等國(guó)的近海也有分布。該魚肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“北方石斑”之稱［2］，是中國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)魚類。對(duì)大瀧六線魚的生物學(xué)研究目前主要集中在形態(tài)、生態(tài)、遺傳育種等領(lǐng)域［3-6］，但關(guān)于其細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，作者主要研究了培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子對(duì)大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟組織原代培養(yǎng)的影響，建立了3種組織的原代培養(yǎng)體系，旨在為細(xì)胞系的構(gòu)建以及應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚 大瀧六線魚購(gòu)自大連黑石礁海邊魚市，全長(zhǎng)為160～220 cm，體質(zhì)量為150～200 g。

1.1.2 培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子 L-15培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶均為Hyclone公司產(chǎn)品;人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)、Ⅰ型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ)、透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶均為Peprotech公司產(chǎn)品;硫酸軟骨素為Wolsen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)

1)鰭、吻端細(xì)胞的培養(yǎng) 將鮮活大瀧六線魚于高雙抗消毒海水 (包含1 000 IU/mL青霉素、1 000 μg/mL鏈霉素)中暫養(yǎng)16～24 h后，在超凈工作臺(tái)上取其鰭和吻端組織，分別放入青霉素小瓶中并加入新配置的雙抗消毒液 (包含100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)處理30 min。將雙抗吸出，分別用PBS和含有5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗組織塊一次。用無(wú)菌眼科剪刀將組織塊剪成1 mm3的碎塊。再用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的透明質(zhì)酸酶和體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化30 min。最后用含有5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基充分懸浮并接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。16 h后，補(bǔ)加培養(yǎng)基至 5 mL/瓶。

2)腎細(xì)胞的培養(yǎng) 將經(jīng)過(guò)高雙抗消毒海水暫養(yǎng)的鮮活大瀧六線魚置于超凈工作臺(tái)上，取其腎臟組織放入青霉素小瓶中。分別用PBS和含有5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗組織塊一次。用無(wú)菌眼科剪刀將組織塊剪成1 mm3的碎塊。最后用含有5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基充分懸浮并接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。10 h后，補(bǔ)加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)組織生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)在鰭、吻端和腎臟組織塊中分別加入含有20%FBS的L-15、DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基，于25℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察各組織在3種不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的貼壁和遷出情況，確定最適培養(yǎng)基。

1.2.3 不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞貼壁率和遷出率的影響試驗(yàn) 選用DMEM/F12培養(yǎng)基，分別添加bFGF、硫酸軟骨素、IGF-Ⅰ 3種生長(zhǎng)因子，各生長(zhǎng)因子的質(zhì)量濃度設(shè)置如下:bFGF為2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL;硫酸軟骨素為10、20、40、80 μg/mL;IGF- Ⅰ 為 10、20、40、80 ng/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行，對(duì)照組培養(yǎng)瓶中不加任何生長(zhǎng)因子，同樣設(shè)3個(gè)平行，在25℃、pH 7.2和5%CO2的條件下培養(yǎng)，24～28 h后，觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況。

1.2.4 原代細(xì)胞染色體的分析 取原代培養(yǎng)的鰭、吻端、腎組織細(xì)胞各1瓶，加入秋水仙素，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到1 μg/mL。25℃下繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液1 mL，消化1 min，待細(xì)胞変圓后，吸去胰蛋白酶溶液，補(bǔ)加最適培養(yǎng)基，用吸管吹打培養(yǎng)瓶底，制成細(xì)胞懸液，并收集于離心管中，以1 000 r/min離心10 min后棄上清。用0.075 mol/mL KCl溶液于25℃下低滲30 min，再以1 500 r/min離心5 min。用Carnoy固定液固定3次，每次15 min，并放入冰箱內(nèi)冷凍過(guò)夜。然后再一次離心，棄上清，向收集的細(xì)胞沉淀中加入新配制的固定液1 mL，采用冷滴片法滴片過(guò)火，室溫下自然干燥。用Giemsa染液染色2 h，自然干燥。在Olympus顯微鏡下統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目并拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)組織生長(zhǎng)的影響

原代培養(yǎng)7 d后，鰭、吻端和腎臟組織細(xì)胞在FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基中均有大量細(xì)胞遷出，遷出的細(xì)胞占瓶底面積的10%以上，在L-15和DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的3種組織細(xì)胞的遷出數(shù)量相對(duì)較少，腎臟組織分別為8%和6%，鰭為6%和4%，吻端組織僅為4%和2%。可見(jiàn)，含有20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基更適合于大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

2.2 不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞貼壁率和遷出率的影響

從圖1可見(jiàn):當(dāng)bFGF質(zhì)量濃度為5.0 ng/mL時(shí)，3種組織的貼壁率和遷出率均最高，鰭組織的貼壁率和遷出率分別為92.1%、85%;吻端組織的貼壁率和遷出率分別為58.9%、50%;腎臟組織的貼壁率和遷出率分別為97.8%、89.7%。當(dāng)bFGF的質(zhì)量濃度達(dá)到20.0 ng/mL時(shí)，鰭細(xì)胞和腎細(xì)胞的遷出率均小于對(duì)照組，吻端細(xì)胞的貼壁率小于對(duì)照組，說(shuō)明bFGF質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞增殖。

圖1 bFGF質(zhì)量濃度對(duì)鰭、吻端和腎臟組織貼壁率和遷出率的影響Fig.1 The effects of bFGF at different concentrations on attachment rate and cell emigration of fin，lip and kidney tissues

從圖2可見(jiàn):當(dāng)硫酸軟骨素質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，3種組織的貼壁率和遷出率均最高，鰭組織的貼壁率和遷出率分別為84.4%、65.6%;吻端組織的貼壁率和遷出率分別為96.7%、63.3%;腎臟組織的貼壁率和遷出率分別為95.4%、98.6%。雖然當(dāng)硫酸軟骨素質(zhì)量濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí)，3種組織細(xì)胞的貼壁情況要好于對(duì)照組，但細(xì)胞遷出還是被抑制。

從圖3可見(jiàn):當(dāng)IGF-Ⅰ質(zhì)量濃度為40 ng/mL時(shí)，3種組織碎的貼壁率和遷出率均最高，鰭組織的貼壁率和遷出率分別為90.7%、88.3%;吻端組織的貼壁率和遷出率分別為88.6%、79.8%;腎臟組織的貼壁率和遷出率分別為92.8%、97.4%。當(dāng)IGF-Ⅰ質(zhì)量濃度達(dá)到80 ng/mL時(shí)，細(xì)胞增殖被抑制。

圖2 硫酸軟骨素質(zhì)量濃度對(duì)鰭、吻端和腎臟組織貼壁率和遷出率的影響Fig.2 The effects of chondroitin sulfate at different concentrations on attachment rate and cell emigration of fin，lip and kidney tissues

圖3 IGF-Ⅰ質(zhì)量濃度對(duì)鰭、吻端和腎臟組織貼壁率和遷出率的影響Fig.3 The effects of IGF-Ⅰat different concentrations on attachment rate and cell emigration of fin，lip and kidney tissues

2.3 大瀧六線魚組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況

鰭組織在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后組織塊邊緣增厚，有上皮樣細(xì)胞從周圍遷出 (圖4-A)，培養(yǎng)6 d后有成纖維樣細(xì)胞遷出 (圖4-B)，培養(yǎng)21 d后長(zhǎng)成單層 (圖4-C)。吻端組織在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后組織塊邊緣增厚，培養(yǎng)3 d后有上皮樣細(xì)胞遷出 (圖4-D)，培養(yǎng)10 d后有成纖維樣細(xì)胞遷出 (圖4-E)，培養(yǎng)15 d后長(zhǎng)成單層 (圖4-F)。腎臟組織在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后有大量上皮樣細(xì)胞和腎小管細(xì)胞遷出 (圖4-G)，培養(yǎng)11 d后有成纖維樣細(xì)胞開始遷出并迅速增殖 (圖4-H)，培養(yǎng)18 d后長(zhǎng)成單層(圖4-I)。

2.4 大瀧六線魚原代細(xì)胞的染色體觀察

從染色體制片中選取形態(tài)清晰、分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，大瀧六線魚3種組織原代細(xì)胞中期分裂相的染色體數(shù)目為48條 (圖5)。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基對(duì)鰭、吻端和腎臟細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

本研究中通過(guò)比較大瀧六線魚3種細(xì)胞在L-15、DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基中的貼壁和遷出情況，發(fā)現(xiàn)含20%FBS的DMEM/F12(pH 7.2)是比較適合大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟組織體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這與Irnajoh等［7］報(bào)道的真鯛細(xì)胞系以及樊廷俊等［8-9］建立的褐點(diǎn)石斑魚3種組織細(xì)胞系和圓斑星鰈鰓細(xì)胞系所使用的培養(yǎng)基一致。但目前已建立的其他海水魚細(xì)胞系也有使用L-15培養(yǎng)基［10-12］和 DMEM培養(yǎng)基的報(bào)道。如任國(guó)誠(chéng)等［13］通過(guò)在DMEM培養(yǎng)基中添加抗生素、胎牛血清、花鱸血清和成纖維樣生長(zhǎng)因子，成功建立了漠斑牙鲆胚胎細(xì)胞系。體外培養(yǎng)海水魚類細(xì)胞系所用培養(yǎng)基的不同，可能與魚類的種屬及組織來(lái)源不同有關(guān)。

3.2 生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞貼壁率和遷出率的影響

本研究在培養(yǎng)基中分別添加了bFGF、硫酸軟骨素和IGF-Ⅰ，有效地促進(jìn)了原代培養(yǎng)的鰭、吻端和腎臟組織的貼壁和遷出，取得了很好的效果。bFGF和IGF-Ⅰ是海水魚類細(xì)胞培養(yǎng)中常用的添加因子，這兩種生長(zhǎng)因子的主要作用是與酪氨酸激酶受體結(jié)合并激活其活性，然后激活Ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)MAP激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，最終進(jìn)入DNA合成期和分裂期，從而刺激細(xì)胞增殖［14-15］。樊廷俊等［8］在用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)褐點(diǎn)石斑魚細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加10 ng/mL bFGF和40 ng/mL IFG-Ⅰ能促進(jìn)褐點(diǎn)石斑魚3種組織細(xì)胞的增殖能力。任國(guó)誠(chéng)等［13］通過(guò)添加2 ng/mL bFGF促進(jìn)漠斑牙鲆胚胎細(xì)胞的有絲分裂。硫酸軟骨素是一種天然酸性黏多糖，屬于高分子化合物，與細(xì)胞表面及基質(zhì)中其他大分子物質(zhì)密切相關(guān)，不僅對(duì)細(xì)胞具有支持和保護(hù)的作用，而且也能對(duì)細(xì)胞的分化和增殖產(chǎn)生作用［16］。研究表明，硫酸軟骨素能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，可能是由于作為酸性物質(zhì)的硫酸軟骨素能夠改變細(xì)胞的代謝環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞活力，加速有絲分裂［17］。本研究中培養(yǎng)的大瀧六線魚3種組織細(xì)胞在培養(yǎng)11 d后主要都為成纖維樣細(xì)胞，可能與硫酸軟骨素有關(guān)。

圖4 大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟原代細(xì)胞 (100×)Fig.4 Fin，lip and kidney cells from fat greenling in first passage(100×)

圖5 大瀧六線魚鰭原代細(xì)胞染色體中期分裂相 (100×)Fig.5 Photographs of metaphase chromosomes of fin cells from fat greenling in first passage(100×)

3.3 大瀧六線魚組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況和染色體觀察

原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功啟動(dòng)是建立連續(xù)性細(xì)胞系的前提。本研究中體外培養(yǎng)的大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟3種細(xì)胞均質(zhì)透明，生長(zhǎng)分裂旺盛，形態(tài)均為成纖維樣細(xì)胞。首次培養(yǎng)的72 h內(nèi)首先遷出的是上皮樣細(xì)胞，之后長(zhǎng)梭型的成纖維樣細(xì)胞開始遷出，隨著上皮樣細(xì)胞停止分裂并漂起，成纖維樣細(xì)胞大量增殖并匯合成原代單層細(xì)胞。Bejar等［18］用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)金頭鯛鰭細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，鰭組織同時(shí)遷出了上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞，但培養(yǎng)幾天后上皮樣細(xì)胞停止生長(zhǎng)。上皮樣細(xì)胞的死亡可能與細(xì)胞壽命有關(guān)，也可能與培養(yǎng)基中相應(yīng)的生長(zhǎng)因子的缺乏有關(guān)，尚需作進(jìn)一步地研究。

真核生物的染色體數(shù)量具有物種特異性，是一種較為準(zhǔn)確的細(xì)胞種屬鑒定指標(biāo)。本研究中對(duì)染色體的觀察結(jié)果顯示，大瀧六線魚3種組織原代細(xì)胞的染色體數(shù)目為48條，與卓孝磊等［19］報(bào)道的大瀧六線魚染色體數(shù)目相同。除能證明所用的試驗(yàn)材料為大瀧六線魚外，還說(shuō)明現(xiàn)有試驗(yàn)條件滿足3種組織生長(zhǎng)的需要，細(xì)胞通過(guò)有絲分裂增殖。同時(shí)本研究為利用原代細(xì)胞進(jìn)行染色體分析提供了一種有效的方法。

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