李洋，劉萍，李健，李吉濤，高保全

(1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023;2.中國水產科學院黃海水產研究所，山東青島266071)

脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda又名白蝦、小白蝦、五須蝦、青蝦、絨蝦、迎春蝦等，隸屬于節(jié)肢動物門Arthropoda、甲殼綱Curstacea、十足目Decapoda、游泳亞目Natantia、長臂蝦科Palaemonidae、長臂蝦屬Palaemon、白蝦亞屬Exopalaemon，系熱溫帶海區(qū)底棲蝦類，以黃渤海產量最高，是中國特有的3種經(jīng)濟蝦類之一，其產量僅次于中國對蝦Fenneropenaeus chinensis和中國毛蝦Acetes chinensis［1］。脊尾白蝦具有肉質細嫩、味道鮮美、繁殖能力強、生長速度快、生長季節(jié)長和環(huán)境適應性廣等優(yōu)點。近年來，隨著沿海灘涂的開發(fā)，養(yǎng)殖面積迅速擴大，已成為池塘單養(yǎng)、魚蝦貝類混養(yǎng)和蝦池秋冬季養(yǎng)殖的重要品種［2］。

目前，國內對脊尾白蝦的研究主要集中在混養(yǎng)技術、急性毒性試驗以及鹽度和中草藥等對其存活、生長的影響研究，王李寶等［3］對脊尾白蝦養(yǎng)殖過程中使用藥物劑量進行了急性致毒試驗;曹梅等［4］研究了鹽度波動和中草藥制劑對脊尾白蝦存活、生長和免疫的影響;張興國［5］對脊尾白蝦的混養(yǎng)技術進行了報道。但對于脊尾白蝦細胞遺傳學方面的研究尚未見報道。隨著脊尾白蝦產量和市場需求的日益增長，為了更好地進行人工養(yǎng)殖、育種、選種等研究工作，對脊尾白蝦的種質資源等基礎研究顯得極為迫切。王青等［6］先后對十足目甲殼動物共計27科96種進行了染色體數(shù)目的研究，其中對3科20種進行了核型分析;姜葉琴等［7］對太湖秀麗白蝦Exopalaemon modestus進行了染色體及核型的研究。本研究中，作者對同為白蝦屬的脊尾白蝦染色體進行研究，旨在為脊尾白蝦的遺傳育種、人工養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

于2010年7—8月從萊州灣捕撈野生脊尾白蝦活體，于實驗室暫養(yǎng)24 h后，在解剖鏡下挑選親蝦抱卵已發(fā)育到原腸胚時期的受精卵，以備用。

1.2 方法

1.2.1 染色體的制備 將受精卵從親蝦游泳肢上剝離，放入用50%的海水 ［φ(海水) ∶φ(蒸餾水)=1∶1］配制的體積分數(shù)為0.04%的秋水仙素中處理3 h，并用50%的海水沖洗干凈秋水仙素，使用0.075 mol/L的 KCl溶液低滲處理50 min，加入預冷到4℃的卡諾氏 (Carnoy)固定液［φ(甲醇)∶φ(冰乙酸)=3∶1)，15 min更換一次固定液，更換3次后置于4℃下保存。制片時使用50%的冰醋酸溶液進行解離，用熱滴片法制片，用吉姆薩染液染色20 min，慢慢沖去染液，晾干后鏡檢。

1.2.2 染色體臂長的計算 染色體臂長的計算公式為

相對長度=(實測染色體長度/全部染色體長度總和)×100，

臂比=長臂長度/短臂長度。

2 結果

2.1 脊尾白蝦染色體數(shù)目的確定

對50尾雌蝦受精卵進行滴片，從中挑選100個中期分裂相清晰的滴片進行染色體計數(shù)，染色體條數(shù)在90時的出現(xiàn)頻率最高，達到81%，結果列于表1，由此確定脊尾白蝦染色體數(shù)目為2n=90。

表1 脊尾白蝦二倍體染色體數(shù)目的統(tǒng)計Tab.1 Chromosome counts in ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

2.2 脊尾白蝦染色體的相對長度和臂比值分析

將所拍照片輸入計算機經(jīng)放大處理后利用投影儀描繪輪廓，并對清晰的中期分裂相染色體的長臂長、短臂長進行測量與分析。脊尾白蝦染色體相對長度和臂比值列于表2。根據(jù)Levan等［8］提供的染色體核型分類依據(jù)，將脊尾白蝦染色體分為4類，其中中部著絲粒染色體 (m)共計56條，亞中部著絲粒染色體 (sm)共計8條，亞端部著絲粒染色體 (st)共計12條，端部著絲粒染色體(t)共計14條，故核型公式為2n=56m+8sm+12st+14t=90。圖1為依據(jù)染色體相對長度排列后的核型圖，圖2為染色體中期分裂相。

表2 脊尾白蝦染色體的相對長度、臂比及核型Tab.2 Relative length and arm ratio of metaphase chromosomes in ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

3 討論

細胞遺傳學是研究細胞中染色體遺傳規(guī)律的學科，同時也是在細胞層次上進行遺傳學研究的遺傳學分支學科，主要研究細胞中染色體的起源、組成、變化、行為和傳遞等機制及其生物學效應。核型是細胞有絲分裂中期的全套染色體圖像按大小、形態(tài)成對排列的總和。染色體的核型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結構、型態(tài)與功能之間的關系所不可缺少的重要手段。同時核型分析還是開展雜交育種、多倍體誘導等遺傳育種操作的基礎。對于脊尾白蝦人工養(yǎng)殖、育種、選種等研究工作也具有重要意義。

圖1 脊尾白蝦原腸胚染色體核型圖Fig.1 Karyotype of the ridgetail white prawn Exopalaemon cariniauda

圖2 脊尾白蝦染色體的中期分裂相Fig.2 Metaphase chromosomes of the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

在甲殼綱十足目動物中因其染色體數(shù)目眾多，而且其有絲分裂中期染色體大多呈點狀，給核型分析帶來了很大的難度。李雅娟等［9］針對不同倍性泥鰍雜交后代的染色體數(shù)目采用低滲法進行了研究并取得了較好的效果;劉萍等［10］和錢國英等［11］分別在中國對蝦和日本沼蝦Macrobrachium nipponense的染色體制備過程中就低滲法和管滲法進行了比較分析，認為整體上低滲法比管滲法效果要好;張?zhí)熹龋?2］和周麗青等［13］分別在羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii和波紋唇魚Cheilinus undulatus的染色體制備過程中采用了研磨離心和熱滴片的方法進行制片，在染色體數(shù)目眾多且不易分散的種類中采用熱滴片法進行制片技術已經(jīng)非常成熟;Ojima等［14］首次提出低滲法制片以來經(jīng)過試驗檢驗制片效果非常完善。因此，本研究中在參考前人方法的基礎上通過實際操作，采用低滲法和熱滴片法獲得了脊尾白蝦原腸胚時期受精卵染色體的清晰分裂相，在操作過程中，為使染色體更好地分散開，可適當提高滴片溫度和高度;為使染色體停滯在分裂中期，使用秋水仙素的處理時間和濃度要通過梯度試驗來確定，通過低滲可以使細胞膨脹染色體間距拉大，經(jīng)過解離對獲得清晰分裂相有很大作用。

脊尾白蝦染色體數(shù)目為90條，與姜葉琴等［7］對同為白蝦屬的秀麗白蝦的染色體研究結果一致，根據(jù)Ahmed［15］提出的核型穩(wěn)定性觀點分析，脊尾白蝦具有較多的m型核型，由此認為其具有較為穩(wěn)定的染色體組型。根據(jù)Murofuehi等［16］的十足類染色體倍數(shù)性進化觀點，認為染色體數(shù)目少的十足類核型則更為原始。根據(jù)邱高峰等［17-18］的研究表明，脊尾白蝦染色體數(shù)目與沼蝦屬和長臂蝦屬的染色體數(shù)目及核型組成方面相近。綜合比較后作者認為，脊尾白蝦的進化地位要比同為長臂蝦科的長臂蝦屬和沼蝦屬更為原始。

在已研究的十足目中只有鎧甲蝦科、方蟹科和異尾類中發(fā)現(xiàn)了性染色體［6］。Nakamura 等［19］也曾在十足目物種中發(fā)現(xiàn)了性染色體，而本研究中雖未發(fā)現(xiàn)性染色體，但也不能確定性染色體不存在，因為脊尾白蝦染色體性狀多為點狀，而且數(shù)目龐大，制片過程中分散不均勻不清晰導致對其常染色體和性染色體的區(qū)分非常困難。因此，對脊尾白蝦性染色體還需采用其他方法進行深入地研究，進一步對其進行補充與完善。

［1］Xu W，Xie J，Shi H，et al.Hematodinium infections in cultured ridgetail white prawns，Exopalaemon carinicauda，in eastern China［J］.Aquaculture，2010，300:25-31.

［2］王興強，閻斌倫，馬甡，等.脊尾白蝦生物學及養(yǎng)殖生態(tài)學研究進展［J］.齊魯漁業(yè)，2005，22(8):21-23.

［3］王李寶，萬夕和，朱彬，等.二硫氰基甲烷對脊尾白蝦的急性致毒實驗［J］.海洋水產研究，2008，29(5):120-123.

［4］曹梅，王興強，閻斌倫，等.鹽度波動和中草藥制劑對脊尾白蝦存活、生長和免疫的影響［J］.安徽農業(yè)科學，2010，38(7):3512-3515.

［5］張興國.脊尾白蝦與梭子蟹、貝類混養(yǎng)技術［J］.齊魯漁業(yè)，2008，25(4):35-36.

［6］王青，孔曉瑜，于珊珊，等.十足目染色體研究進展［J］.海洋科學，2005，29(6):60-65.

［7］姜葉琴，謝書海，周琴，等.秀麗白蝦染色體核型的初步分析［J］.水產科學，2008，27(9):470-472.

［8］Levan A，F(xiàn)redga K，Aandberg A A.Noenelature for centromeric position on chromosomes［J］.Hereditas，1964，52(2):201-220.

［9］李雅娟，錢聰，印杰，等.不同倍性泥鰍雜交后代染色體數(shù)目組成的研究［J］.大連海洋大學學報，2012，27(4):326-332.

［10］劉萍，麥明，孔杰，等.中國對蝦染色體制備及染色體形態(tài)的研究［J］.海洋科學，1994，23(1):33-37.

［11］錢國英，汪財生，伊尚軍.日本沼蝦染色體制備的比較研究［J］.實驗生物學報，2005，38(5):456-460.

［12］張?zhí)熹跤聒P.羅氏沼蝦的染色體研究［J］.華中師范大學學報，2003，37(2):231-232.

［13］周麗青，楊愛國，吳彪，等.波紋唇魚染色體制備及核型的初步研究［J］.漁業(yè)科學進展，2010，31(1):54-58.

［14］Ojima Y S，Hitotsumachi S.Cytogenetic studies in lower vertebrates［J］.Proc Jap Acad，1966，42(1):62-66.

［15］Ahmed M.Chromosome cytology of marine pelecypod molluscs［J］.Sci Karachi，1976(4):77-94.

［16］Murofuehi M，Deguehi Y.Karyotype evolution in Decapoda Crustacea［C］//Hirano R，Hanyu I.Proc Second Asian Fisheries Forum.Tokyo:Japan Asian Fisheries，1990:549-553.

［17］邱高峰，堵南山，賴偉.日本沼蝦染色體及其核型的研究［J］.海洋與湖沼，1994，25(5):493-498.

［18］邱高峰.羅氏沼蝦核型及長臂蝦亞科演化關系的探討［J］.水產學報，1996，20(4):294-300.

［19］Nakamura H K，Machii A，Wada T，et al.A check list of decapod chromosomes(Crustacea)［J］.Bull Natl Inst Aquac，1988，13:1-9.