舒佳賓，文 李，官春云

(1國家油料作物改良中心湖南分中心，長沙410128;2長沙理工大學食品與生物工程系，長沙410114;3衢州市農(nóng)業(yè)科學研究所，浙江衢州324000)

油菜是世界上除大豆之外的第二大油料作物，占全世界植物油供應的13%［1］。中國是油菜生產(chǎn)大國，種植面積和產(chǎn)量居世界之首，其產(chǎn)量和品質影響著中國食用油的安全。油菜菌核病常年發(fā)病率在10% ～30%［2］，每年 可 以 使油 菜的 產(chǎn)量 減 少15% ～30%，種子含油量也相應降低1% ～5%［3］。有研究表明，蛋白質組學技術的快速和高通量特點可為植物抗病研究提供新的方向［4，5］。

蛋白質雙向電泳(Two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2 － DE)技術［6，7］是利用蛋白質等電點和分子量的不同來對蛋白質進行分離。它通過第一向的等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)使蛋白質按照等電點進行初次分離，然后通過第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)使蛋白質再按照分子量的大小進行第2次分離，進而得到蛋白質的二維分離圖譜，圖譜中的每個點代表樣品中一個或多個蛋白質，而且可以同時呈現(xiàn)出蛋白質的等電點、分子量和在樣品中相對含量等屬性。近年來，該技術已經(jīng)被成功的運用到擬南芥［8］、水稻［9，10］、小麥［11］、大豆［12］、煙草［13］、番茄［14］等植物的蛋白組學研究，而在油菜蛋白質組學研究中主要涉及油菜葉片［15］、花［16，17］、種子［18］、根系［19］等材料。筆者比較了甘藍型油菜葉片蛋白質的提取方法，探討了蛋白質雙向電泳技術優(yōu)化方案，為運用蛋白質組學方法研究甘藍型油菜抗菌核病提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為抗菌核病甘藍型油菜近等基因系98c40和湘油15×98c40(由湖南農(nóng)業(yè)大學油料作物研究所培育提供)，盛花期時利用牙簽接種，取葉片進行實驗。

尿素、SDS、硫脲、Tris－ HCl、Gly、二硫蘇糖醇(DTT)、3－［3－(膽酰胺基丙基)二甲氨基］丙磺酸(CHAPS)、溴酚藍、PVP購自Sigma公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、N，N’－甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、IPG Buffer、碘乙酰胺、兩性電解質、礦物油、低熔點瓊脂封膠液、30%甘油溶液、考馬斯亮藍G250購自Bio－Rad公司;牛血清白蛋白(BSA)、蛋白質電泳 Loading buffer等購自天根生物;其余生化試劑為國產(chǎn)分析純。Protein IEF等電聚焦儀、灌膠模具、電泳儀、GS－800掃描儀等均購自Bio－Rad公司;恒溫循環(huán)水浴鍋購自AmerSham，凍干機為EYELA FDU－2100。

1.2 方法

1.2.1 葉片蛋白質的提取

用TCA/丙酮法提取葉片總蛋白，參照Damerval等［20］的方法，但略做改進。即取1 g葉片，放入預冷的研缽中，迅速加入液氮，并加入約10%PVP和適量石英砂充分研磨成粉末，迅速懸浮于約10倍體積－20℃預冷的含10%三氯乙酸(TCA)和0.07%二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液中，充分混勻后放在－20℃冰箱中靜置過夜，期間顛倒混勻數(shù)次。4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清;在沉淀中加入約10倍體積－20℃預冷的含0.07%二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液，混勻后放在－20℃冰箱中靜置1 h后，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清，重復4～5次該步驟。將最后獲得的沉淀放入凍干機中進行真空冷凍干燥，干燥后的粉末－80℃保存?zhèn)溆?。在整個提取過程中盡量保持低溫，并加入1 mmol/L的PMSF，以防蛋白質水解。

用Tris－Cl法提取葉片總蛋白。取1 g葉片，迅速放入預冷的研缽中，加入液氮、石英砂和PVP充分研磨。迅速將其轉移到離心管中，加入冰上預冷的蛋白提取混合液Ⅰ(65 mmol/L Tris－HCl，調pH值至6.8，0.5%SDS，10%甘油，5%β－巰基乙醇)，漩渦震蕩1 min，放入4℃冰箱中靜置30 min，期間每10 min震蕩混勻1次，4℃12 000 rmp離心30 min，取上清轉移到新的離心管中;加入10倍體積預冷的蛋白提取混合液Ⅱ(10%TCA，0.07%DTT的丙酮混合液)，混勻后放入－20℃冰箱中靜置1 h，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清;再加入預冷的含0.07%DTT的丙酮溶液震蕩混勻，放入－20℃冰箱中靜置1 h，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清，該步驟重復3～5次。將最后獲得的沉淀放入凍干機中進行真空冷凍干燥，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質的定量

在1 mg蛋白質樣品中加入25 μL水化液(8 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，0.001% 溴酚藍，臨用前加入1.3 mmol/LDTT，0.5%IPG Buffer，1 mmol/L PMSF)，在30℃下震蕩溶解30 mim，室溫下12 000 rmp離心30 min。蛋白質的定量按照Bradford法，以牛血清白蛋白做標準曲線進行蛋白質含量的測定。

1.2.3 蛋白質的雙向電泳

(1)第一向等電聚焦(IEF)。采用17 cm Bio－Rad固相預制膠條，并按照Bio－Rad雙向電泳操作手冊進行。根據(jù)1.2.2介紹方法定量測定蛋白質的含量，計算出所要吸取的樣品量，本實驗的上樣量分別采用1 mg和800 μg進行比較，上樣體積為300 μL。將樣品加入到聚焦槽中，然后把膠條表面的保護膜去掉，膠面朝下，輕輕放入膠槽中，該過程中應避免氣泡的產(chǎn)生。覆蓋一層礦物油后，放入等電聚焦儀的電極板上，先50 V水化14 h，再按照表1進行等點聚焦。

表1 等電聚焦程序

(2)膠條的平衡。將膠條放入平衡液Ⅰ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris － HCl，20%甘油，130 mmol/L DTT)中，置于搖床上輕搖15 min;然后放入平衡液Ⅱ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris－HCl，20%甘油，135 mmol/L 碘乙酰胺)，置于搖床上輕搖15 min。

(3)第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)。將平衡后的膠條用SDS－PAGE電極緩沖液沖洗一下，并側置于濾紙上約1 min，然后轉移至分離膠上，并在負極端的外側加上蛋白質分子量標準蛋白，排凈氣泡后，用低熔點瓊脂糖封膠液封閉，待封膠液凝固后開始進行第二向垂直電泳。開啟恒溫循環(huán)泵使其保持在15℃，30 mA/兩塊膠，恒流電泳30 min后，改用60 mA/兩塊膠，恒流電泳大約7.5 h，當溴酚藍距膠底約1 cm處停止電泳。

(4)染色。運用改良的考馬斯亮藍染色法。染色前用12%的TCA溶液固定1 h，取200 mL染色液(12% 考馬斯亮藍 G250，10%(NH4)2SO4，10%H3PO4)加入50 mL甲醇混合后，放到搖床上輕搖12～24 h進行染色，脫色采用0.1 mol/L Tris－H3PO4(pH 6.5)浸泡1 min，再用25%甲醇漂洗至背景為無色。再復染1次(搖床上2～5 h即可)，再脫色。

1.2.4 凝膠掃描和圖像分析

待SDS－PAGE凝膠脫色完全后，用Bio－Rad GS－800掃描儀和Quantity One軟件進行圖像掃描，掃描分辨率為 300 dpi，掃描得到的圖像用PDQuest 8.0.1進行圖像分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質提取方法比較

本實驗分別采用TCA/丙酮法和Tris－Cl法進行葉片蛋白質的提取，用pH為3～10的17 cm預制膠條跑出的雙向電泳圖如圖1所示。從圖中虛線框中可以看出，用TCA/丙酮法提取的蛋白(圖1－A)與Tris－HCl法(圖1－B)相比，表現(xiàn)出更好的聚焦效果，基本沒有條紋狀蛋白，且背景也相對清晰。從實線框中對比可以看出，用TCA/丙酮法能夠分離出更多的蛋白點，蛋白點清晰，且高豐度的蛋白點有所減少。由于油菜葉片中含有大量的鹽離子、多糖多酚、色素等植物次生代謝產(chǎn)物，對蛋白質雙向電泳產(chǎn)生一定的干擾，重復性差。所以本實驗在傳統(tǒng)TCA/丙酮蛋白質提取方法的基礎之上，在研磨中加入石英砂和PVP，使研磨更充分，并通過PVP去除多糖多酚和色素，使雙向電泳的重復性提高。試驗中發(fā)現(xiàn)，第1次TCA/丙酮沉淀時放在－20℃過夜，期間需要隔1～2 h震蕩混勻1次，后面重復沉淀1 h，沉淀5次左右提取的蛋白質純度較好。因此，用改良后的TCA/丙酮法更適合甘藍型油菜葉片蛋白的提取。

圖1 不同提取方法下甘藍型油菜葉片蛋白質雙向電泳圖

2.2 上樣量的確定及蛋白酶抑制劑添加

從圖2可以看出，蛋白質成塊的聚集在一起，是加樣量過多的表現(xiàn)，通過實驗發(fā)現(xiàn)上樣量為每17 cm膠條800 μg較適宜。在提取過程中未加入蛋白酶抑制劑PMSF，容易使蛋白質大量降解，呈模糊的涂抹狀，不利于雙向電泳的進行。

圖2 不同上樣量及蛋白酶抑制劑雙向電泳圖

2.3 預制膠條和分離膠濃度的選擇

從圖3可以看出，pH3～10的膠條不能把蛋白質很好的分離，大部分蛋白質主要集中在pH4～7之間(圖3－A)，改用pH4～7的膠條重新進行雙向電泳后發(fā)現(xiàn)，原來集中在pH3～10中間的蛋白點已經(jīng)被很好的分離開(圖3－B)，說明用pH4～7的膠條比較合適。

第二向SDS－PAGE中，分離膠濃度影響蛋白質的分離效果。從圖4－A中虛線框中可以看出，10%的聚丙烯酰胺凝膠不能很好地使不同分子量的蛋白質得到分離，蛋白質呈縱向條狀或聚集成一片;而改用12%的聚丙烯酰胺凝膠后，分離效果明顯提高。從圖4－B和圖3－B中可以看出，運用12%的分離膠結合pH 4～7的膠條，能使蛋白質很好的分離，能夠分離出2 000多個蛋白點。

圖3 不同pH膠條雙向電泳圖

圖4 不同分離膠濃度雙向電泳圖

2.4 復染對蛋白點呈現(xiàn)的影響

從圖5可以看出，圖5－A中虛線框部位只隱約看見幾個點，經(jīng)過2～5 h復染脫色后，在圖5－B中很多點變得清晰，而且呈現(xiàn)出圖5－A中很多原來沒有的點，其他部位的點也相應增加或增強。該現(xiàn)象在后續(xù)的試驗中都得到了很好的驗證，都使蛋白質點增多增強，而且背景基本不加深。這可能是在第1次染色中趨于飽和，但通過脫色過程中甲醇、水等物質的作用，膠的性質發(fā)生變化，使其更易和染料結合，從而使低豐度的蛋白質更好的呈現(xiàn)。

圖5 不同染色次數(shù)的蛋白點呈現(xiàn)效果圖

3 討論與結論

甘藍型油菜葉片中存在大量的酚類、多糖類、醌類、脂類和色素等植物次代謝產(chǎn)物，多糖中存在高電荷密度能夠以離子鍵與蛋白質結合，多酚能與蛋白質能以氫鍵結合，干擾蛋白質等電聚焦，所以在提取蛋白質時應盡量去除雜質，且減少蛋白質的降解［21］。周蘊薇等［22］在研磨時加入 PVP能有效去除葉片中多糖多酚等物質。不同的蛋白質提取方法能夠導致最后蛋白質點的差異［23～26］，Saravanan 等［25］報道在西紅柿中使用三種不同的蛋白質提取方法獲得2－DE蛋白質點具有很大的區(qū)別。這可能由于蛋白質提取過程中糖基化不同而造成的。而對于不同的實驗材料因所含糖類、脂類、色素等物質的不同，所選用的最適提取方法也有所不同［27］。本實驗結合前人研究，在葉片研磨時加入約10%PVP和適量的石英砂，運用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質，比用Tris－HCl法獲得的雙向電泳圖像更清晰，分離更充分，且穩(wěn)定性好，適合甘藍型油菜葉片雙向電泳蛋白質的提取。

第二向分離膠合適濃度的選擇是蛋白質充分分離的基礎。分離膠的濃度與凝膠孔徑成反比，蛋白質或多肽在膠中的遷移速率與其分子量成反比［28］當分離膠濃度過小時，容易使小分子蛋白質丟失［29］。本研究通過對比10%和12%分離膠濃度對蛋白質的分離效果，確定12%的分離膠濃度能使甘藍型油菜葉片蛋白質得到很好的分離。

本試驗結果表明，采用改進的TCA/丙酮法比Tris－HCl法更適合甘藍型油菜葉片蛋白質的提取;用pH為4～7的固相膠條和12%的SDS－PAGE凝膠能夠使蛋白質得到充分分離;上樣量為800 μL時得到的圖片比上樣量為1 mg時清晰，分離充分，不產(chǎn)生聚集現(xiàn)象;采用膠塊2次復染方法，可加強蛋白質點的染色效果，使低豐度蛋白得以呈現(xiàn)，給后續(xù)分析帶來便利的同時，增加了差異蛋白點的數(shù)目，提高了實驗的解析度。總之，通過本實驗的研究，建立和優(yōu)化了適合甘藍型油菜葉片雙向電泳體系，提出膠塊復染的作用效果，能夠分離出2 000個以上的蛋白點，且實驗穩(wěn)定重復性強，可為后續(xù)油菜抗菌核病的蛋白質組學研究提供參考。

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