金 華，鄒吉祥，宋春鳳，李長田，樸仁哲**

（1.大連民族學院，遼寧大連，116600；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉，133000；

3.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連，116622；4.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春，130118）

金針菇 （Flammulina velutiper）又名毛柄小火菇、構菌、樸菇、冬菇、樸菰、凍菌、金菇、智力菇等，隸屬真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬[1]。金針菇是中國主要栽培食用菌之一，分為黃色和白色2大品系[2-3]，有表現(xiàn)野生型的黃褐色菌株，突變的純白菌株和一系列中間顏色的淺黃菌株[4]。金針菇味道鮮美,營養(yǎng)豐富 ,是著名的食藥兩用菌，有 “益智菇 ”等美稱 ,具有很高的開發(fā)價值和廣闊的前景[5]。它廣泛分布于中國、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有分布。在中國北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長[6]。ITS序列是真菌基因組rDNA的內(nèi)轉錄間隔區(qū)，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之間，在物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)系統(tǒng)進化關系研究中有一定的價值[7]。ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析[8]。目前國內(nèi)外對利用ITS序列分析鑒定金針菇的研究報道較少，本研究通過真菌核糖體ITS1和ITS4通用引物對不同品種、不同來源的金針菇材料PCR擴增，進行ITS序列分析，并通過在GenBank中的金針菇ITS序列進行比較，旨在從分子水平上鑒定金針菇親緣關系，為金針菇菌株的區(qū)分鑒定、遺傳多樣性分析和種質資源評價提供技術依據(jù)。

表1 供試材料編號及產(chǎn)地

1 材料與方法：

1.1 材料

所用材料為河南駐馬店市金針菇和吉林延吉地區(qū)的金針、金白、日金三個金針菇樣品，將各金針菇樣品ITS序列提交NCBI，并獲得登錄號，另有5個金針菇的ITS序列來自GenBank。

1.2 方法：

1.2.1 DNA提?。?/p>

采用改良的SDS法提取DNA將提取的DNA，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增ITS區(qū)段：

采用真菌 ITS序列的通用引物ITS1（5′-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（ 5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）對樣品進行擴增。PCR反應體系：用 25μl PCR 反應體系：2.5μl 10×PCR buffer(Mg2+)、 2μl dNTP(各 2.5 mmol·L-1)、 引物分別加入 0.5μl(10 μl·L-1)、0.5μl Taq DNA 聚合酶 (5U·μl-1)、 0.5μl DNA 模板，用水補至25 μl。PCR擴增條件：94℃預變性2 min，94℃變性40 s秒，52℃復性1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃保溫5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 ITS區(qū)段克隆及測序：

將擴增出來的核酸片段在上海生物工程公司純化后測序。其中吉林省延吉市的3個金針菇樣品測序圖重疊峰嚴重，為查明原因，通過上海生物工程公司克隆測序，每個樣品測6個克隆。

1.2.4 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建：

將測序結果通過ClustalVersion2.1軟件、BLAST工具和DNAMAN軟件配合手動排序，分析G+C含量和變異位點，并在GenBank注冊，所得序列號見表1。利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析比對分析，并以自展法 (boot strap)進行檢測，共循環(huán)1 000次，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹 (Neighbor joining tree)。使用MEGA5.0中的Maxi mum Composite Likelihood模型構建序列遺傳距離矩陣。

2 結果與分析：

2.1 ITS序列長度與GC含量分析：

所有供試材料ITS總長度在712-719bp范圍內(nèi) (見表1)，G+C含量為49.4%~49.9%。其中ITS1在244 bp~249 bp范圍內(nèi)，G+C含量為47.2%~48.0%；ITS2在308 bp~311 bp范圍內(nèi)，G+C含量為52.1%~53.6%。5.8S rDNA進化過程中高度保守[8，12~14]，所以不做分析。分析表明，金針菇ITS區(qū)G+C含量變化較小，ITS2的長度和G+C含量均大于ITS1。

2.2 ITS序列突變位點分析：

對吉林地區(qū)金針菇樣品的測序圖進行檢查，發(fā)現(xiàn)重疊峰嚴重，在ITS序列中存在堿基的插入或缺失的情況。為研究堿基的變異情況，對樣品的PCR產(chǎn)物進行克隆測序，對測序結果比對分析。分析表明，吉林地區(qū)金針菇共有13個突變位點，其中，樣品1、樣品2、樣品3的突變位點分別為：8個、8個、11個，說明其序列均沒有同步進化，而其他六個金針菇樣品各自進化比較穩(wěn)定。

2.3 ITS排序及序列位點的分析：

通過clustalx1.83對序列進行排序，結果所有序列共有35個位點發(fā)生變異，其中可用于分析的信息位點13個，ITS1區(qū)有8個，ITS2區(qū)有5個 (見表3)。

ITS區(qū)共有變異位點35個；信息位點13個，占總變異位點的37.14%。其中ITS1有21個變異位點，8個變異信息位點，占總變異信息位點的61.54%，ITS2有13個變異位點，5個變異信息位點，占總變異信息位點的38.46%。ITS2的變異信息位點數(shù)高于ITS1。

堿基變異類型有C-T和G-A轉換，C-A顛換，缺失變異，T→C轉換5個，占38.46%；A→G轉換有2個，占15.38%；C→A顛換1個，占7.69%；有5個缺失位點占38.46%，說明堿基變異類型以轉換為主。

2.4 金針菇ITS序列遺傳距離分析：

采用MEGA5.0根據(jù)Maximum Composite Likelihood參數(shù)分析得到序列間遺傳距離 (見表3)。9個金針菇樣品的平均距離為0.005。遺傳距離最大為0.014，樣品1、樣品2、樣品 3、樣品 4、樣品 5之間的遺傳距離最小，為0.000，說明它們的ITS序列為同源序列。其余樣品遺傳距離均小于0.1，說明它們親緣關系較近，表示其遺傳分化可能發(fā)生很晚或者種群間的基因流動發(fā)生頻繁。

表2 吉林地區(qū)3個金針菇材料ITS序列突變位點的比較

表3 供試材料ITS的變異信息位點

表4 基于rDNA-ITS序列的遺傳距離比較

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建：

根據(jù)測序結果，利用MEGA 5.0軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，用靴帶自展法 （Bootstrap）檢驗發(fā)育樹，重復1000次，判斷各分支處的可信度 (圖1)。廣東省廣州市與其他樣品處于樹的兩大分支上，說明ITS序列可用于鑒別金針菇的親緣關系，其余8個樣品中，吉林省延吉市 （金針）、吉林省延吉市 （金白）、吉林省延吉市 （日金）、河南省駐馬店市、遼寧省大連市的金針菇樣品在樹的最小分支上，得到了Bootstrap值的有力支持 (57%)，表明這五個地區(qū)的金針菇在ITS區(qū)極其相似，但不能通過ITS序列區(qū)分吉林延吉地區(qū)的3個金針菇品種。

圖1 基于ITS序列構建九個金針菇材料的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

在進化過程中ITS序列所受到的選擇壓力非常小，能夠允許更多的變異，進化速率較快，在大部分的真核生物中都表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，能夠顯示種群內(nèi)最近的進化特征[9]，且ITS序列分析受主觀因素的影響較小[10]。ITS區(qū)序列已經(jīng)應用于真菌中很多屬種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進化的研究，在揭示分布于不同區(qū)域的或間斷分布種群的關系具有更大的潛力[11]。目前ITS序列對金針菇系統(tǒng)發(fā)育的研究較少，本文采用不同地區(qū)金針菇以及不同品種的金針菇為材料進行ITS序列分析，并與GenBank上的金針菇序列比較，發(fā)現(xiàn)ITS序列變異信息豐富，且主要集中在ITS2區(qū)域上，其中延邊地區(qū)三個金針菇樣品ITS序列重疊峰嚴重，通過克隆測序發(fā)現(xiàn)各品種間進化不同步[12]，ITS序列上正在發(fā)生變異，尚未形成顯著差異，這可能是導致無法用ITS序列區(qū)分延邊地區(qū)金針菇屬3個品種的原因。根據(jù)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹判斷，廣東省廣州市的樣品與其他樣品處于樹的兩大分支上，其余樣品之間又出現(xiàn)很多分支，河南地區(qū)、遼寧地區(qū)和延邊地區(qū)的3個金針菇樣品處于同一個最小分支上，說明這3個地區(qū)的金針菇親緣關系較近，可見，ITS序列能夠鑒定金針菇的親緣關系的遠近。不同地區(qū)的環(huán)境差異對金針菇屬的變異影響較大，其中某些地區(qū)金針菇屬種類的ITS區(qū)變異較晚，單純用ITS序列無法對所有金針菇種類進行有效的分類鑒定。ITS區(qū)變異豐富，對ITS區(qū)進行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS序列信息，而且為真菌分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的資料和依據(jù)[13]，從而成為系統(tǒng)與進化研究中重要的分子標記，本研究也為將來的真菌親緣關系分析提供了重要的理論依據(jù)。

然而以ITS序列作為分子標記應用技術的最大限制是，有的真菌由于進化順序、變異、甚至分析方法等原因，在間隔區(qū)表現(xiàn)的差異性比較小，不適于屬內(nèi)種及種群的標記，這就得依賴于其他基因序列的有力補充。相信隨著分子生物技術的發(fā)展，采用分子方法進行物種間分類、鑒定、親緣關系的確定會更加精確。

[1]于榮利、秦旭升、宋鳳菊.金針菇研究概況 [J].食用菌學報，2004.11 （4）：63-68.

[2]王波，彭衛(wèi)紅，甘炳成.金針菇33個菌株遺傳多樣性與組織分離菌株鑒定的酯酶同工酶分析 [J].西南農(nóng)業(yè)學報，2008,21（2）：448-450.

[3]楊成香，張瑞穎,左雪梅，姜瑞波,李順鵬.金針菇遺傳多樣性初步分析[J].中國食用菌，2007，26 （4）：37～39.

[4]蟻瑞榮，曹暉、潘迎捷.金針菇單核出菇與子實體顏色 [J].食用菌學報，2007.14 （2）：33-36.

[5]宋冬靈、曾憲賢、呂杰等.金針菇遺傳育種研究進展 [J].種子，2007,26 （5）：52-54.

[6]黃晨陽.同工酶和RAPD標記在金針菇菌株鑒定和遺傳多樣性研究中的應用[D].福建.福建農(nóng)林大學，2002:1-33.

[7]鄭和斌，王作仁，呂作舟等．美味側耳ITS序列直接測序與克隆測序比較分析[J]．食用菌學報，2005，12（1）：1-4.

[8]陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35 （13）：3785-3786.

[9]鄭雪松，楊虹，李道棠等．基因間隔序列在細菌分類鑒定和種群分析中的應用[J]．應用與環(huán)境生物學報，2003，9（6）：678-684．

[10]劉娜娜.黃楊屬部分植物nrDNAITS序列測定及親緣關系分析[D].南京林業(yè)大學，2010:1-75.

[11]基于rDNA-ITS序列分析對10株野生桑黃菌屬、種鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育進化的研究[D].西北農(nóng)林科技大學，2010:1-36.

[12]Mao SHIBA，Kenji KONDO，Eiji MIKI，et al.Identi cation of Medicinal Atractylodes Based on ITS Sequences of nrDNA.[J].Biol.Pharm.Bull，2006，29(2)：315-320.

[13]陳鳳毛.真菌ITS區(qū)序列結構及其應用 [J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21 （2）：5-7.