張春梅，宋 海，魏生龍

（1.河西學院食用菌研究所，甘肅 張掖 734000；2.河西學院化學化工學院，甘肅 張掖 734000；3.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

荷葉離褶傘 Lyophyllum decastes，隸屬于擔子菌綱、傘菌目、口蘑屬、離褶傘屬食用真菌[1]，味道鮮美，屬野生優(yōu)良食用菌[2]。李林玉等探討了荷葉離褶傘生長所需的營養(yǎng)條件[3]，魏生龍等報道了荷葉離褶傘分離馴化[4]和生物學特性研究[5]，該菌種保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”（保藏號 CGMCC 1518，菌株號ZY48－1），該菌種于2008年獲得了國家發(fā)明專利授權[6]。關于食用真菌多糖提取工藝的研究很多，傳統(tǒng)工藝有熱水浸提法、稀酸浸提法、稀堿浸提法等，新工藝包括酶法、超聲波輔助法、微波輔助浸提法、超濾法等[7]，其中熱水浸提法為食用菌多糖最經(jīng)典的提取方法，以其工藝簡單、成本低、易于推廣等特點為人們所接受。此前對荷葉離褶傘菌絲體多糖提取工藝方面的研究報道極少，而其水溶性多糖抗氧化性能的研究未見報道。本文對荷葉離褶傘多糖提取工藝進行研究，得到一種優(yōu)化方案，并以還原力為依據(jù)，研究了荷葉離褶傘多糖的抗氧化活性，為其進一步的開發(fā)利用以及天然保健品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

荷葉離褶傘由河西學院食用菌研究所提供，菌種保藏號 CGMCC NO.1518，菌種編號 ZY48-1，專利申請?zhí)?00510096405.0，公開號CN1923997A。

1.1.2 液體菌種培養(yǎng)基配方

將玉米面加水調(diào)制成懸液，加入0.1%淀粉酶，于70℃水浴鍋中酶解5 h；大豆先用水浸泡24 h，用豆?jié){機打漿，加入0.1%蛋白酶，于55℃水浴鍋中酶解5 h。然后用300目篩過濾，濾液中加入白糖，加水定容。

1.1.3 液體菌種培養(yǎng)

將供試試管菌種置于22℃恒溫箱內(nèi)活化24 h，接入250 mL三角瓶（100 mL）中，置于 22℃、轉速 120 r·min-1的恒溫搖床上，連續(xù)培養(yǎng)7 d。將該菌種接入20 L液體菌種培養(yǎng)罐中，接種量10%，恒溫22℃、通氣量20 L·h-1，連續(xù)培養(yǎng)7 d獲得液體菌種。

1.1.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

將液體菌種按10%的接種量接入200 L發(fā)酵罐中，給予攪拌轉速 160 r·min-1、罐壓 0.2 MPa、通氣量 80 L·h-1、pH 6.5、溫度20℃的培養(yǎng)條件，連續(xù)培養(yǎng)8 d。

1.2 儀器與設備

DFT-50流水式中藥粉碎機，青州三陽包裝設備有限公司；UV-9100分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、KQ-B玻璃儀器氣流烘干器，鞏義市予華儀器有限公司；RE-85C旋轉蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠；HK-2A超級恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠；DHG-9070(A)電熱干燥箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；AR1530電子精密天平，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇、無水乙醇、三氯乙酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗多糖浸提過程中的單因素試驗

選擇原料的粉碎度（目數(shù)），浸提過程中的料水比、溫度、時間，醇沉時的乙醇添加倍數(shù)、提取次數(shù)為因素，研究各因素下浸提液中的粗多糖得率。

1.3.2 粗多糖浸提過程中最佳工藝條件的確定

在單因子實驗的基礎上，設計了正交試驗以優(yōu)化荷葉離褶傘多糖提取工藝。選擇提取時間、料水比、提取溫度、乙醇濃度四個對多糖提取影響較大的因素，按L9(34)設計四因素、三水平的正交試驗，以優(yōu)化浸提過程的工藝條件。每個處理3個重復，取各提取率的平均值。

1.3.3 粗多糖浸提最佳工藝條件驗證試驗

在正交試驗確定的最佳工藝條件下進行試驗，以驗證粗多糖浸提過程中工藝條件的可靠性。

1.4 多糖的提取工藝及含量測定

1.4.1 標準曲線的繪制

精確稱取于105℃條件下干燥至質(zhì)量恒定的葡聚糖50.0 mg，于50 mL量瓶中，加適量水溶解后定容，搖勻備用。分別精密移取該溶液0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL于 10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻后各取2.0 mL于25 mL具塞刻度試管中（每個處理3個重復），另取2.0 mL蒸餾水作空白對照。分別加入質(zhì)量分數(shù)為5.0%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，立即搖勻。放置10 min，置于沸水浴中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光度A。以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標、A為縱坐標，繪制標準曲線。計算得歸回方程為Y=0.160293A-0.0125，r=0.9992，Y為葡萄糖的含量（mg），A為吸光度，r為相關系數(shù)。

1.4.2 荷葉離褶傘菌絲體多糖提取工藝流程

發(fā)酵罐培養(yǎng)8 d后，用300目篩過濾，經(jīng)真空冷凍（-70℃、12 h） 干燥→粉碎→浸提→4 000 r·min-1離心10 min取上清液→Sevag法除蛋白→離心取下層澄清液→旋轉蒸發(fā)儀濃縮→加乙醇沉淀4℃冰箱中過夜→離心（4 000 r·min-1）10 min取沉淀→沉淀用乙醇洗滌2次→定容顯色→測吸光度→粗多糖得率。

1.4.3 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸顯色法[8]測定多糖含量，以葡萄糖溶液為標準。多糖提取率（P）公式如下：

式中：C為荷葉離褶傘多糖質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為荷葉離褶傘多糖提取液的體積（mL）；m為荷葉離褶傘菌絲體粉末質(zhì)量（mg）。

1.5 還原力測定

參考 Oyaizu[9]的方法。分別吸取濃度為 200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1、800 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1的荷葉離褶傘菌絲體多糖溶液和抗壞血酸（Vc）溶液各1.0 mL置具塞試管中，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol·L-1，pH6.6） 和質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液5 mL，置于50℃水浴中反應20 min，然后加入體積分數(shù)10%的三氯乙酸5 mL，搖勻，于5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，室溫下反應10 min后在波長700 nm處測定光密度值（以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液），光密度值越大表明還原力越強。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)處理并進行Duncan新復極差多重比較分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示（X±SE），p<0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 粉碎度對粗多糖得率的影響

粉碎的目的在于增加原料與萃取劑之間的接觸面積，理論上粉碎度越大越好，但提取過程中包括擴散、滲透、溶解過程，實踐證明粉碎度并非越大越好。粉碎度對荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響見表1。

表1 粉碎度對荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響

從表1可以看出，隨著粉碎度的增大，粗多糖得率提高，當原料粉碎度為100目時，粗多糖得率達到（2.75±0.1368）%，粗多糖得率最高；粉碎度進一步增大，粗多糖得率降低。因此，確定粉碎度為100目。

2.1.2 料液比對粗多糖得率的影響

稱取100目原料按不同料液比在90℃浸提3 h，添加3倍乙醇，4℃冰箱過夜。一般來說，液料比越大提取效果越好。但是，從細胞中提取多糖的過程除了簡單的擴散過程之外，還有受細胞膜影響的阻滯擴散過程，而阻滯擴散速度取決于細胞膜結構。當溶劑用量增加到一定時再增加也不會提高溶劑中多糖含量。料液比對荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響見表2。

表2 料液比對荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響

從表2可以看出，料液比達到1∶80時，粗多糖得率最高，考慮到液料比太高會加重后續(xù)的濃縮以及純化工的能耗。因此，確定料液比為1∶80。

2.1.3 浸提溫度對粗多糖得率的影響

稱取100目原料按料水比1∶80在不同溫度下浸提3h，添加3倍乙醇，4℃冰箱過夜醇沉。浸提溫度對粗多糖得率的影響見表3。

從表3可以看出，隨著浸提溫度的升高，粗多糖得率顯著提高，但超過一定溫度后，高溫長時間的浸提會破壞多糖的結構，同時考慮到高溫會使雜質(zhì)溶出量增加，為后續(xù)處理帶來不便，并影響其生物活性。因此，溫度不宜過高，確定浸提溫度為90℃。

2.1.4 浸提時間對粗多糖得率的影響

表3 浸提溫度對粗多糖得率的影響

稱取100目原料按料水比1∶80在90℃下浸提不同時間，添加3倍乙醇，過夜醇沉。浸提時間對粗多糖得率的影響見表4。

表4 浸提時間對粗多糖得率的影響

從表4可以看出，隨著浸提時間的延長，粗多糖得率顯著提高；2.5 h后，粗多糖得率有下降趨勢，可能是時間過長導致多糖遭受破壞。因此，確定浸提時間為2 h。

2.1.5 乙醇沉淀倍數(shù)對粗多糖得率的影響

乙醇沉淀多糖主要取決于多糖的濃度和多糖的類別，化學組成和分子量。選擇不同乙醇沉淀倍數(shù)進行實驗，結果見表5。

表5 乙醇沉淀倍數(shù)對粗多糖得率的影響

從表5可以看出，隨著乙醇沉淀倍數(shù)的增加，多糖的含量也在增加，隨著乙醇添加倍數(shù)的繼續(xù)增大，粗多糖得率仍有提高，但與乙醇添加倍數(shù)3相比，差異并不顯著。考慮到能耗問題，確定3倍乙醇沉淀多糖。

2.1.6 乙醇體積分數(shù)對粗多糖提取率的影響

醇沉濃度是影響多糖提取的最主要因素。一般情況下，多糖的分子量越大，被沉淀下來所需的乙醇濃度越小；乙醇濃度越大，沉淀下來的分子量越小，多糖得率越高。乙醇體積分數(shù)對粗多糖得率的影響見表6。

從表6可得知，多糖提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加先增加后下降，在乙醇體積分數(shù)為95%時多糖提取率達到最大值（4.55±0.0356）%。乙醇體積分數(shù)超過95%后，多糖提取率變化不明顯，且增加提取成本。因此，確定乙醇體積分數(shù)為95%。

2.2 荷葉離褶傘菌絲體粗多糖提取工藝的優(yōu)化

選擇料液比、浸提溫度、浸提時間、乙醇體積分數(shù)4個對多糖提取影響較大的因素，按L9(34)設計四因素、三水平的正交試驗，見表7、表8。

表6 乙醇體積分數(shù)對粗多糖得率的影響

表7 正交實驗因素和水平表

表8 荷葉離褶傘菌絲體多糖提取正交實驗方案

由極差分析得出影響效果為B＞A＞C＞D，進一步根據(jù)各水平的均值比較，確定熱水提取荷葉離褶傘菌絲體多糖的最佳工藝參數(shù)為A2B1C2D3,即浸提溫度90℃、浸提時間2 h、料液比1∶80、乙醇體積分是95%。

2.3 粗多糖浸提最佳工藝條件的驗證試驗

在最佳工藝條件下進行提取多糖的驗證實驗，稱取原料按目數(shù)100，料水比1∶80，90℃浸提2 h，重復2次，得率分別為4.12%、4.34%，則平均得率為4.23%，高于正交試驗的各組，說明試驗中得出的工藝條件是可靠的。

2.4 多糖還原力測定結果

抗氧化劑能夠通過自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性；還原力越大，抗氧化能力就越強。因此可根據(jù)Fe3＋還原為Fe2＋的多少來間接評價各種提取物的抗氧化能力。在試驗濃度范圍，還原力測試液的吸光值隨著濃度的增加而增大（圖1），低濃度時吸光值較低，當濃度增至1 000 μg·mL－1時，測試混合液的吸光值為0.435，說明荷葉離褶傘菌絲體多糖具有一定的還原力，但與抗壞血酸Vc相比，還原力較弱。

圖1 荷葉離褶傘菌絲體多糖的還原能力

3 討論與結論

多糖不僅是機體主要供能物質(zhì)，同時還具有多種多樣的生物學功能，在生命活動中參與了細胞的各種活動。在我國的中藥現(xiàn)代化進程中，研究天然多糖無論是在藥學方面還是在藥理學方面都已取得了明顯的進步[10，11]。許多研究表明，高等真菌子實體和菌絲體多糖具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、降血糖等活性[12－15]。以往的真菌多糖多從子實體中提取得到，由于生產(chǎn)周期長、勞動強度大、受氣候影響嚴重，產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定，且子實體木質(zhì)化程度高，多糖提取效率較低。本研究采用熱水提取、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白提取了荷葉離褶傘菌絲體多糖，工藝操作簡單，較適用于工業(yè)生產(chǎn)。在單因素試驗基礎上通過正交試驗，確定了影響荷葉離褶傘菌絲體多糖提取率因素的主次關系是：浸提溫度＞浸提時間＞料液比＞乙醇體積分數(shù)。荷葉離褶傘菌絲體多糖提取最優(yōu)工藝條件是粉碎度100目、料水比1∶80（g·mL－1）、浸提溫度90℃、浸提時間2 h、添加3倍95%乙醇醇沉。苯酚－硫酸法測定此最佳提取工藝條件下粗多糖得率可達4.23%。

生物體中不斷產(chǎn)生的羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2－·），具有很強的氧化能力，當它們的存在超出機體防御系統(tǒng)所具有的清除能力時，這些自由基及其誘導的氧化反應就會直接或間接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA鏈斷裂，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導致各種疾病發(fā)生[16]。多糖結構中的醇羥基可以與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子絡合，使羥自由基的產(chǎn)生受到抑制，最終抑制活性氧的產(chǎn)生[17]。本試驗是通過體外實驗對荷葉離褶傘粗多糖的抗氧化功效進行測定。結果表明，荷葉離褶傘多糖具有一定的體外抗氧化能力，且在供試濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加而增強，但與抗壞血酸Vc相比，還原力較弱。而在生物體內(nèi)多糖的抗氧化作用途徑更為復雜。作為外源性抗氧化劑，多糖作用的機理除直接參與猝滅自由基的途徑外，還可能通過參與調(diào)動或激活機體的內(nèi)源性抗氧化劑，從而避免或減輕自由基對機體的損傷。多糖在實驗體系中表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，這可能是多糖抗衰老、抗炎癥、降血脂、抗腫瘤等功效的藥理基礎[18]。目前，國內(nèi)外已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價，對保健食品開發(fā)具有積極作用[19]。因此，可開發(fā)具有抗氧化、抗衰老作用的荷葉離褶傘多糖功能性保健食品，有關荷葉離褶傘多糖體內(nèi)抗氧化作用及與其多糖的種類、結構及在生物體內(nèi)的生物學活性差異有待進一步研究。

[1]黃年來．中國大型真菌原色圖鑒[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2]卯曉嵐．中國經(jīng)濟真菌[M]．北京：科學出版社，1998.

[3]李林玉，李榮春．荷葉離褶傘菌絲營養(yǎng)條件的初步研究[J]．中國食用菌，2004，24(3)：30-32.

[4]魏生龍，王治江，于海萍，等．荷葉離褶傘分離馴化研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學報，2005，14(5)：128-131.

[5]魏生龍，王治江，于海萍，等．荷葉離褶傘生物學特性研究[J]．菌物學報，2005，25(1)：101-108.

[6]魏生龍．荷葉離褶傘食用菌菌種：中國，ZL200510096405.0[P].2008-07-02.

[7]陳欣，龔蘭，劉冠卉．食用真菌多糖提取條件的優(yōu)化及其還原力的比較[J]．食品科學，2010，31(14)：140-144.

[8］張維杰.糖復合物生化研究技術（2版）[M]．杭州：浙江大學出版社，2006.

[9]Oyaizu M.Antioxidative activity of browning products of glucosaminefractionated by organic solvent and thin layer chromatography[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1986(35):771-775.

[10]王紅英．中藥多糖研究進展[J]．實用醫(yī)技雜志，2006，13(6)：10-21.

[11]鄧小云，丁登峰，戴美紅，等．植物多糖藥理作用研究進展[J].中醫(yī)藥導報，2006，12(9)：45-53.

[12]Chung CS,Lu MK,Cheng JJ,et al.An tiangiogenic activities of polysaccharides isolated from medicina fungi[J].Fems Microbiol Lett,2005(249):247-254.

[13]Li SP,Zh ang GH,Zeng Q,et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide with antioxidation isolated from cultured Cordyceps mycelia[J].Phytomedicine,2006(13):428-433.

[14]Zhang M,Cui SW,Cheung PCK,et al.Antitum or polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process,structural characteristics and antitum or activity[J].Trends Food Sci.Tech.,2007(18):4-19.

[15]Wasser SP.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002(60)：258-274.

[16]盛偉，方曉陽．杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)與胞外多糖體外抗氧化活性研究[J]．中國林副特產(chǎn)，2009(1)：7-10.

[17]Volpi N,Tarugi P.Influence of chondroitin sulfate charge density,sulfate group position,and molecularmass on Cu2+-mediated oxidation of human low-density lipoproteins:Effect of normal human plasma derived chondroitin sulfate[J].The Journal of Biochemistry,1999(125):297-304.

[18]顧有方，李衛(wèi)民，李升和，等．大棗多糖對小鼠四氯化碳誘發(fā)肝損傷防護作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2006，13(2)：105-107.

[19]鄭晶泉．抗氧化劑抗氧化實驗研究進展[J].國外醫(yī)學：衛(wèi)生學分冊，2000，27(1)：37-40.