康小虎，蔡亞東，孫宜法，謝 放，任愛梅，孟憲剛

（蘭州交通大學化學與生物工程學院生物工程系，甘肅 蘭州 730070）

羊肚菌又名羊肚菜，是一種野生名貴食（藥）用真菌，因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。尖頂羊肚菌（Morchella conica）是羊肚菌中非常重要的一類，其菌體內含有多糖等活性成分，能增強人體的免疫功能，具有較強的抗衰老、抗腫瘤等作用[1，2]。我國羊肚菌分布廣泛,主要分布在甘肅、青海、四川、云南、黑龍江等地。甘肅羊肚菌資源主要分布在甘南州、天水、隴南、慶陽等地，其中甘南藏族自治州山區(qū)尖頂羊肚菌分布較多，以尖頂羊肚菌（M.conica）、小羊肚菌（M.deliciosa）、小頂羊肚菌 （M.angusticeps）、粗柄羊肚菌 （M.crassipes）最為常見[3]。其中尖頂羊肚菌營養(yǎng)豐富，氨基酸、礦物質和微量元素種類齊全，含量豐富[4]，很有研究價值，但目前關于甘南州羊肚菌的研究開發(fā)工作鮮見報道。另一方面，羊肚菌子實體的人工栽培是非常困難的，但所幸的是羊肚菌的菌絲體在營養(yǎng)成分上與子實體相當[5]，因此，研究羊肚菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)技術，對甘南州羊肚菌資源的開發(fā)利用意義重大。本文研究了甘南藏族自治州尖頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基組分和最佳培養(yǎng)條件，為其工業(yè)化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

采自甘肅省甘南州迭部縣的尖頂羊肚菌，由蘭州交通大學種苗工程研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯（去皮） 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 18 g·L-1，自然 pH。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 100 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 20 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH 7.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH7.0。

1.1.3 主要儀器設備

氣浴恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干燥箱、超凈工作臺、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

斜面菌種接種于PDA平板上，25℃靜置避光培養(yǎng)4 d~5 d，菌絲可長滿平板。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)

從活化好的羊肚菌PDA平板上用打孔器取得約1 cm2的菌絲體，接入到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL） 中，置于25℃、100 r·min-1的搖床上避光培養(yǎng)4 d，即可作為液體發(fā)酵菌種備用。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實驗

（1）碳源、氮源單因素篩選試驗

碳源篩選實驗：以2%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖的替液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，其它組分和液體發(fā)酵培養(yǎng)基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)7 d。重復實驗3次，測定菌絲體生物量。

氮源篩選實驗：以1%的蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨代替液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母浸膏作為氮源，其它組分和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)7 d。重復實驗3次，測定菌絲體生物量。

（2）無機鹽篩選實驗

根據王小雄[4]對甘肅甘南州羊肚菌營養(yǎng)成分分析和王新宇[6]對甘南州羊肚菌菌絲體生長的研究，選取KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4以及CaCl2七種無機鹽，設計L8(27)正交試驗，試驗方案見表1。

表1 無機鹽正交試驗方案

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化實驗

根據碳源、氮源單因素實驗結果和無機鹽正交實驗結果，以干菌絲體得率為考量指標，綜合考慮原料來源和價格因素，選擇影響羊肚菌干菌絲體得率的主因素。碳源為白砂糖，氮源為豆粕粉，無機鹽為 MgSO4·7H2O和KH2PO4。另外，任桂梅[7]等的研究認為維生素B1作為生長因子對食用菌菌絲體的生長影響明顯，故將維生素B1作為生長因子，設計L16(45)正交試驗，試驗方案見表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗方案

1.2.4 液體搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎上，以不同溫度、初始pH值、接種量、培養(yǎng)時間和轉速，設計L16(45)正交試驗，以干菌絲體得率為指標，確定最佳發(fā)酵條件，試驗方案見表3。

表3 液體發(fā)酵條件正交試驗方案

1.2.5 干菌絲體得率的計算

發(fā)酵液用紗布過濾，所得菌絲球用去離子水清洗3次~5次，置于80℃烘箱中干燥2 h至恒重，計算干菌絲體得率。干菌絲體得率（P，g·L-1）公式為：

式中：m為干菌絲體質量（g）；v為發(fā)酵液體積（L）。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源的單因素篩選實驗結果及分析

2.1.1 碳源篩選實驗

在不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后，菌絲體呈現(xiàn)微黃色的菌球，直徑為5 mm~15 mm不等，不同碳源生長條件下獲得的干菌絲體得率的差異如圖1所示。

由圖1中可看出，所選碳源均能培養(yǎng)產生菌絲體。蔗糖、葡萄糖和白砂糖作為碳源獲得的干菌絲體是相對較高的，分別為 6.86 g·L-1、6.55 g·L-1、6.67 g·L-1，三者之間無明顯差異，其主要原因是它們都屬于速效碳源，培養(yǎng)初期（5 d前）菌絲體生長很好，但是以葡萄糖為碳源時，在培養(yǎng)后期（5 d后）菌絲體的自溶現(xiàn)象是最明顯的。其次是玉米粉（5.12 g·L-1），可溶性淀粉最低（3.94 g·L-1）。綜合菌絲體得率、碳源來源、價格等因素考慮，選擇白砂糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

2.1.2 不同氮源生長條件下獲得的干菌絲體得率情況

不同氮源生長條件下所獲得的干菌絲體得率，其差異情況見圖2。

圖1 不同碳源對干菌絲體得率的影響

所選氮源均能產生一定量的菌絲體。蛋白胨、酵母浸膏和豆粕粉為氮源獲得的干菌絲體得率較高，分別是7.63 g·L－1、8.02 g·L－1、7.95 g·L－1，三者之間差異不大，其次是硫酸銨（6.70 g·L－1），氯化銨（5.63 g·L－1）最低。分析原因可能是前三者均屬復合型氮源，其中含有羊肚菌生長因子和微量元素，菌絲體的生長速率較快。綜合考慮不同氮源干菌絲體得率、原料來源、使用成本等因素，選擇豆粕粉為液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖2 不同氮源對羊肚菌干菌絲得率的影響

2.2 無機鹽篩選實驗結果及分析

選取 KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CaCl2七種無機鹽，每種無機鹽設2水平，設計L8(27)正交試驗，試驗方案和結果見表4。

以干菌絲體得率為考察指標，極差分析顯示無機鹽對干菌絲體得率影響主次關系 A（KH2PO4）=C（MgSO4·7H2O）＞G（CaCl2）＞B（K2HPO4）＞D（ZnSO4）＞E（FeSO4·7H2O）＞F（MnSO4），其中KH2PO4和MgSO4·7H2O極差值最大，說明這兩種無機鹽對菌絲體生長量影響最大，因此選取這兩種無機鹽為發(fā)酵培養(yǎng)基組分。

表4 無機鹽正交試驗結果及分析

2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化實驗結果及分析

根據碳源、氮源單因素試驗結果和無機鹽正交試驗結果，以干菌絲體得率為考量指標，設計L16(45)正交試驗。試驗因素包括碳源白砂糖、氮源豆粕粉、無機鹽KH2PO4和MgSO4·7H2O，生長因子維生素B1，每因素設四水平，試驗方案及結果見表5。

從表中極差值R可以得到發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳水平組合A3B3C3D2E3，即白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。

2.4 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，設計不同溫度、初始pH值、接種量、轉速和培養(yǎng)時間5個因素，每因素四水平，設計L16(45)正交試驗，以干菌絲體得率為考量指標、確定最佳發(fā)酵條件，實驗方案及結果見表6。

極差分析結果顯示最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件組合為A3E4B3C2D2，即最佳液體發(fā)酵條件為溫度30℃，培養(yǎng)液初始 pH7，接種量 10 mL，轉速 120 r·min－1，培養(yǎng)時間為 8 d。

3 結論

本文通過設計正交試驗對甘南州尖頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。確定的最佳培養(yǎng)基配比為白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H200.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。液體搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件為溫度30℃，培養(yǎng)液初始pH7，接種量10 mL，轉速 120 r·min－1，培養(yǎng)時間 8 d。

[1]張松.食用菌學[M].廣東：華南理工大學出版社，2000.

[2]李娟，王臻，姚良同，等.羊肚菌多糖研究進展[J].微生物學雜志，2005，25(4)：89－91.

[3]杜品.甘南州林區(qū)的大型藥用真菌[J].中國食用菌，1999，19(1)：19－20.

[4]王小雄，付華，鄭尚珍，等.尖頂羊肚菌深層發(fā)酵菌絲體營養(yǎng)成分的研究[J].西北師范大學學報，1997，33（2）：38-40.

表5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗結果及分析

[5]趙桂云，馬慶斌.羊肚菌液體培養(yǎng)基配方的研究[J].食用菌，2002(6)：15-16.

[6]王新宇，梁祖炳，蒲訓.三種不同羊肚菌菌絲體的生長、蛋白質合成和酯酶同功酶的組成[J].真菌學報，1996，15(3)：220-226.

表6 液體發(fā)酵條件正交試驗結果及分析

[7]任桂梅，周茂林，毋楠.維生素B1對幾種擔子菌菌絲體生長的影響[J].安徽農業(yè)科學，2007，35(26)：8075-8076.