劉 彤，侯宏衛(wèi)，張小濤，陳 歡，唐綱嶺，胡清源

（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001）

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中的可替寧

劉 彤，侯宏衛(wèi)，張小濤，陳 歡，唐綱嶺，胡清源

（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001）

為了準(zhǔn)確測定吸煙者與非吸煙者尿液中可替寧含量水平，建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS／MS）測定方法。尿液經(jīng)稀釋、離心和過濾，引入LC－MS／MS，經(jīng) Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18色譜柱（150mm×2.1mm，3.5μm）分離，以0.1% 甲酸水溶液－0.1% 乙酸甲醇溶液為流動相，采用梯度洗脫方式，以電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行分析。方法檢出限為0.08μg／L，線性范圍為1～500μg／L，空白樣品中加標(biāo)回收率范圍在94.3%～99.9%，精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計）為0%～3.2%。利用此方法檢測了58個非吸煙者和246個吸煙者尿液中可替寧的含量水平，結(jié)果表明：吸煙者24h尿液中的可替寧含量是非吸煙者的180多倍，但是由于個體之間以及吸煙行為之間的差異，尿液中的可替寧含量并不隨卷煙主流煙氣中煙堿含量的升高而升高。

可替寧；高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；尿液；中國烤煙型卷煙

煙堿，俗稱尼古丁，是一種存在于茄科植物（茄屬）中的生物堿，也是煙草的重要成分，占煙草中總生物堿的98%［1］。煙堿是煙草的主要活性成分，也是導(dǎo)致吸煙成癮或產(chǎn)生依賴性的主要因素［2］。進(jìn)入人體內(nèi)的尼古丁約80%在肝臟中的細(xì)胞色素酶P4502A6的作用下代謝為可替寧［3］，其結(jié)構(gòu)示于圖1?？商鎸庪S血液進(jìn)入到人體各個部位，在血液［4－5］、尿液［6］、唾液［1］等體液和肝臟及腦等器官中均發(fā)現(xiàn)可替寧的分布?？商鎸幵隗w內(nèi)的半減期為18～22h，且由于尼古丁是可替寧的唯一來源，因此是目前公認(rèn)的評價卷煙煙氣暴露的特異性生物標(biāo)志物［4］。

圖1 可替寧的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of cotinine

由于尿液具有非創(chuàng)傷性、來源廣等特點，被廣泛的用來評價卷煙煙氣暴露情況。分析尿液中可替寧的方法主要有：酶聯(lián)免疫法［7］、毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法［8］、氣相色譜－質(zhì)譜法［9］、液相色譜法［10－12］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC－MS／MS）［6，11，13－19］。LC－MS／MS比傳統(tǒng)的分析方法靈敏度更高，選擇性更強(qiáng)，但往往需要繁瑣的液液萃取［13－14］或 者固相 萃?。?5］來凈化尿液樣本。Fan等［17］建立了一個直接稀釋過濾進(jìn)樣分析尿液中可替寧的LC－MS／MS方法，此方法簡化了前處理過程，選取了一根常規(guī)的液相色譜柱（柱徑：4.6mm，粒徑：5μm），但其分離的效果不如小粒徑、窄內(nèi)徑的質(zhì)譜色譜柱；且過大的流速（1 mL／min）會增加有機(jī)溶劑和霧化氣體的損耗。本研究旨在建立一種簡單、快速、選擇性好的測定尿液中的可替寧的LC－MS／MS方法，用于中國烤煙型卷煙吸食人群尿液中可替寧的測定，為吸煙人群尿液中可替寧含量水平評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200型液相色譜：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有G1329A自動進(jìn)樣器，G1311A四元混合泵和G1316A柱溫箱；API4000三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）和Analyst 1.5軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

可替寧，可替寧－d3：純度均為98%，同位素純度均為99%，Toronto Research Chemicals Inc公司產(chǎn)品；甲醇和乙酸：美國Tedia公司產(chǎn)品；所有的溶劑均為色譜純；實驗用水均為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

稱取14.3mg可替寧標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.43g／L的可替寧甲醇溶液。準(zhǔn)確移取69μL上述儲備液于10 mL容量瓶中，用超純水定容，得到10mg／L的可替寧水溶液。量取1mL 10mg／L的可替寧水溶液，用水定容到10mL，得到1mg／L的可替寧水溶液。

稱取10mg可替寧－d3標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1g／L的可替寧－d3甲醇溶液。準(zhǔn)確移取100μL上述儲備液于10mL容量瓶中，用超純水定容，得到10mg／L的可替寧－d3水溶液。

1.3 尿液樣品的收集

吸煙和非吸煙志愿者尿液樣本由鄭州大學(xué)國家藥品臨床研究基地提供。所有志愿者在參加試驗前均須簽署一份知情同意書，志愿者為年齡在2l～60歲之間身體健康的吸煙和非吸煙者。其中吸煙者分為3組，分別吸食焦油釋放量為8mg烤煙型卷煙、10mg烤煙型卷煙和13 mg烤煙型卷煙，每人每天15支煙，收集其24h尿液，儲存于－40℃冰箱中備用。

1.4 樣品處理

尿液樣品于室溫下解凍，混合均勻后，取100μL的尿液，加入20μL的氘代內(nèi)標(biāo)，加入880μL純水，以10 000r／min離心10min。離心的上清液過0.22μm聚醚砜水相濾膜，取5 μL濾液引入LC－MS／MS分離分析。

1.5 試驗條件

1.5.1 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18色譜柱（150mm×2.1mm，3.5μm）；流動相 A：0.1% 甲酸水溶液；流動相B：0.1%乙酸甲醇溶液；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫條件：0～2min，30%B；2～5min，90%B；5～7min，30%B；7～8min，30%B；流速為200 μL／min時洗脫尿液樣品，分析時間為8min。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；電噴霧電壓：5 000V；霧化氣壓力：348kPa；氣簾氣壓力：209kPa；輔助加熱氣壓力：348kPa；溫度：500 ℃；碰撞電壓：10 eV；去簇電壓：58V；駐留時間：100ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

用蠕動泵以10μL／min的流速連續(xù)注射，將質(zhì)量濃度為50μg／L的可替寧標(biāo)準(zhǔn)溶液注入ESI離子源中，在正離子模式下對可替寧進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，得到可替寧的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋，然后對此準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行子離子掃描，得到碎片離子信息。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的m／z177.2、m／z 98.0作為定量離子對，m／z 177.2、m／z80.1為確認(rèn)離子對，m／z 180.2、m／z80.1為對應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)離子對（可替寧－d3）。為了達(dá)到更高的靈敏度，對碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：最優(yōu)的碰撞能量為10eV，去簇電壓為58V，駐留時間為100ms。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

范忠［16］等采用 Agilent Eclipse XDB C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以10mmoL／L（pH 6.8）乙酸銨水溶液和無水甲醇為流動相測定了吸煙者和被動吸煙者尿液中的煙堿及其代謝物，其中可替寧的保留時間為6.41min。為了改善峰形和縮短分析時間、減少有機(jī)溶劑和霧化器的消耗，選取了一根小粒徑、窄內(nèi)徑的色譜柱。為了調(diào)整可替寧的保留時間并且盡量減少雜質(zhì)峰的干擾以獲得更好的峰形，采用1.5的梯度洗脫方法，在此條件下可替寧及其氘代內(nèi)標(biāo)的保留時間為2.63min，分析物在稀釋十倍尿液中峰型較好，基質(zhì)效應(yīng)小于10%。可替寧及其氘代內(nèi)標(biāo)在尿液樣品中的色譜圖示于圖2。

圖2 空白樣本中可替寧及氘代內(nèi)標(biāo)的總離子流圖（a），空白樣本加標(biāo)以后可替寧及氘代內(nèi)標(biāo)的總離子流圖（b），實際樣本中可替寧及氘代內(nèi)標(biāo)的總離子流圖（c），其中可替寧濃度為22.5μg／LFig.2 Total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a blank urine（a）；total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a blank urine added standard（b）；total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a smoker urine（c）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將可替寧的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成1、2、5、10、50、100和500μg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的LC－MS／MS條件下進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，其回歸方程為y＝0.024 2x＋0.009 98，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r為1.000 0。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物在質(zhì)量濃度1～500μg／L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限（LOD），該方法的LOD為0.08μg／L。

2.4 回收率和精密度

采用尿液基質(zhì)加標(biāo)準(zhǔn)品的方法測方法的回收率。選取一個非吸煙者尿液樣本，選取3個添加水平（5，100和400μg／L）加入標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度平行做5次重復(fù)試驗，得到方法的回收率和精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計），結(jié)果列于表1。方法的回收率范圍是94.3%～99.9%，RSD為0%～3.2%。由于尿液只是經(jīng)過簡單的稀釋、離心和過濾處理，其中殘留的蛋白質(zhì)及鹽類的影響，可能會造成回收率略低，但從現(xiàn)有數(shù)據(jù)看，該方法比較可靠。

表1 方法的回收率和精密度（n＝5）Table 1 Recovery and RSD of the LC－MS／MS method

2.5 方法應(yīng)用

利用本研究建立的方法，對304個尿液樣本（其中非吸煙者58人；吸食焦油釋放量為8mg烤煙型卷煙82人；吸食焦油釋放量為10mg烤煙型卷煙82人；吸食焦油釋放量為13mg烤煙型卷煙82人；吸煙者每人每天抽吸15支煙）中的可替寧含量進(jìn)行了檢測。剔除3個離群值（t檢驗）以后，尿液中24h可替寧含量結(jié)果示于圖3，非吸煙者尿液中可替寧的含量范圍為0～36.74μg／24h，平均值為 4.15μg／24h（n＝57）；吸食8mg卷煙者尿液中可替寧的含量范圍為24.01～3066.25μg／24h，平均值為892.35 μg／24h（n＝82）；吸食10mg卷煙者尿液中可替寧的含量范圍為1.51～3599.04μg／24h，平均值為782.28μg／24h（n＝81）；吸食13mg卷煙者尿液中可替寧的含量范圍為24.28～2915.50 μg／24h，平均值為862.50μg／24h（n＝81）。

可替寧具有煙氣特異性，非吸煙者24h尿液中的可替寧可能是來源于環(huán)境煙氣的暴露；吸煙者24h尿液中的可替寧含量明顯高于非吸煙者（約為180倍）。3種不同焦油含量的卷煙主流煙氣中煙堿的含量在ISO條件測定分別為0.8mg（焦油8mg卷煙）、1.1mg（焦油10mg卷煙）和1.2mg（焦油13mg卷煙）。然而尿液中的可替寧并不隨卷煙主流煙氣中尼古丁含量的升高而升高，這可能是由于個體之間以及吸煙行為之間的差異：單口之間的抽吸容量和抽吸頻率都會影響尼古丁的暴露劑量，此外還與吸煙者吸煙時間以及成癮性的大小有關(guān)，煙癮大的人吸食低焦油的卷煙時可能會存在補(bǔ)償抽吸［20］，最終影響尿液中可替寧的含量。

圖3 301個24h尿液樣品可替寧含量的箱線圖Fig.3 Boxplots of cotinine concentrations for 301human 24hurine samples

3 結(jié) 論

本工作建立了一種簡單、快速、選擇性好的測定尿液中可替寧的LC－MS／MS方法。樣品經(jīng)稀釋、離心和過濾后直接進(jìn)樣分析，方法的回收率范圍是94.3%～99.9%，檢出限為0.08 μg／L。利用此方法檢測了58個非吸煙者和246個吸煙者尿液中可替寧的含量水平，吸煙者24 h尿液中的可替寧含量明顯高于非吸煙者。

［1］ KATAOKA H，INOUE R，YAGI K，et al.Determination of nicotine，cotinine，and related alkaloids in human urine and saliva by automated intube solid－phase microextraction coupled with liquid chromatography－mass spectrometry ［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49（1）：108－114.

［2］ BENOWITZ N L.Pharmacologic aspects of cigarette smoking and nicotine addiction［J］.N Engl J Med，1988，319：1 318－1 330.

［3］ MESSINA E S，TYNDALE R F，SELLERS E M.A major role for CYP2A6in nicotine c－oxidation by human liver microsomes［J］.J Pharmacol Ex Ther，1997.282（3）：1 608－1 614.

［4］ 王 俊，宋瑞金.人體內(nèi)可替寧檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.環(huán)境與 健 康 雜 志，2008，25（12）：1 111－1 113.

［5］ IWASAKI Y，GOTO M，MOCHIZUKI K，et al.Development and validation of a hydrophilic interaction chromatography－tandem mass spectrometry for quantification of nicotine and its metabolites in human maternal and cord sera ［J］.Biomedical chromatography：BMC，2011，25（4）：503－513.

［6］ MARCLAY F，SAUGY M.Determination of nicotine and nicotine metabolites in urine by hydrophilic interaction chromatography–tandem mass spectrometry：Potential use of smokeless tobacco products by ice hockey players［J］.J Chromatogr A，2010，1217（48）：7 528－7 538.

［7］ KUO H W，YANG J S，CHIU M C.Determination of urinary and salivary cotinine using gas and liquid chromatography and enzyme－linked immunosorbent assay［J］.J Chromatogr B，2002，768：297－303.

［8］ SUN J Y，DU H W，YOU T Y.Determination of nicotine and its metabolite cotinine in urine and cigarette samples by capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence［J］.Electrophoresis，2011，32（16）：2 148－2 154.

［9］ LAFAY F，VULLIET E，F(xiàn)LAMENT－WATON M M.Contribution of microextraction in packed sorbent for the analysis of cotinine in human urine by GC－MS［J］.Anal Bioanal Chem，2009，396（2）：937－941.

［10］ YANG J，HU Y，CAI J B，et al.A new molecularly imprinted polymer for selective extraction of cotinine from urine samples by solid－phase extraction［J］.Anal Bioanal Chem，2006，384（3）：761－768.

［11］ PETERSEN G O，LEITE C E，CHATKIN J M，et al.Cotinine as a biomarker of tobacco exposure：development of a HPLC method and comparison of matrices［J］.J Sep Sci，2010，33（4／5）：516－521.

［12］ WEN Y H，YANG P S，WU S S.Determination of cotinine in human urine by high－performance liquid chromatography［J］.J Food Drug Anal，2009，17（5）：357－362.

［13］ GABR R Q，ELSHERBINY M E，SOMAYAJI V，et al.A liquid chromatography－mass spec－trometry method for nicotine and cotinine；utility in screening tobacco exposure in patients taking amiodarone［J］.Biomed Chromatogr，2011，25（10）：1 124－1 131.

［14］ APINAN R，CHOEMUNG A，NABANGCHANG K.A sensitive HPLC－ESI－MS－MS method for the determination of cotinine in urine［J］.J Chromatogr Sci，2010，48：460－465.

［15］ MILLER E I，NORRIS H Y K，ROLLINS D E，et al.A novel validated procedure for the determination of nicotine，eight nicotine metabolites and two minor tobacco alkaloids in human plasma or urine by solid－phase extraction coupled with liquid chromatography－electrospray ionizationtandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2010，878（9／10）：725－737.

［16］ 范 忠，劉惠民，謝復(fù)煒，等.LC－MSMS法測定吸煙者和被動吸煙者尿液中的煙堿及其代謝物［J］.煙草科技，2008，（9）：39－42.

［17］ FAN Z，XIE F W，XIA Q L，et al.Simultaneous determination of nicotine and its nine metabolites in human urine by LC－MS－MS［J］.Chromatographia，2008，68（7／8）：623－627.

［18］ DOBRINAS M，CHOONG E，NOETZLI M，et al.Quantification of nicotine，cotinine，trans－3＇－h(huán)ydroxycotinine and varenicline in human plasma by a sensitive and specific UPLC－tandem massspectrometry procedure for a clinical study on smoking cessation［J］.Journal of chromatography B，Analytical technologies in the biomedical and life sciences，2011，879（30）：3 574－3 582.

［19］ WU C F，UANG S N，CHIANG S Y，et al.Simultaneous quantitation of urinary cotinine and acrylonitrile－derived mercapturic acids with ultraperformance liquid chromatography－tandem mass spectrometry ［J］.Anal Bioanal Chem，2012，402（6）：2 113－2 120.

［20］ MUHAMMAD－KAH R，LIANG Q W，F(xiàn)ROSTPINEDA K，et al.Factors affecting exposure to nicotine and carbon monoxide in adult cigarette smokers［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2011，61（1）：129－136.

Determination of Cotinine in Urine Using High Performance Liquid Chromatography－Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

LIU Tong，HOU Hong－wei，ZHANG Xiao－tao，CHEN Huan，TANG Gang－ling，HU Qing－yuan
（China National Tobacco Quality Supervision ＆ Test Centre，Zhengzhou450001，China）

A high performance liquid chromatography－electrospray ionization tandem mass spectrometry（LC－ESI－MS／MS）method was developed for the determination of cotinine in urine.After dilution，centrifugation and filtration，the urine was injected to the LC－MS／MS.The analysis was performed on a Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18column（150mm×2.1mm，3.5μm）using agradient elution with the mobile phases of 0.1%formic acid buffer and 0.1%acetate in methanol（V／V），and determined by tandem mass spectrometry in positive ESI mode under multiple reaction monitoring mode.The limits of determination（S／N＝3）was 0.08μg／L，with a linear calibration range spanning 1—500μg／L.The recoveris ranged from 94.3%to 99.9%at three spiked levels，the relative standard deviations（RSDs）ranged from 0to 3.2%.The method was applied to detect the concertrationof urine cotinine from 58non－smokers and 246smokers.Twenty－four hours urine cotinine levels in smokers was much more than 180times that in non－smokers.However，due to the differences between individuals and smoking behavior，the concertration of urine cotinine did not increase with cigarettes nicotine in the mainstream smoke.

cotinine；liquid chromatography－tandem mass spectrometry；urine；Chinese virginia cigarettes

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0252－05

2012－03－02；

2012－04－28

國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心科研項目（2010JC11）資助

劉 彤（1968～），女（漢），河南鄭州人，工程師，從事煙草化學(xué)、吸煙與健康研究。E－mail：xiaodew＠hotmail.com

侯宏衛(wèi)（1975～），男（漢），陜西鳳翔人，高級工程師，從事煙草化學(xué)、生物標(biāo)志物、吸煙與健康研究。

E－mail：hou＿h(yuǎn)ongwei＠yahoo.com.cn

胡清源（1965～），男（漢），山東淄博人，研究員，從事煙草化學(xué)、生物標(biāo)志物、吸煙與健康研究。E－mail：huqy＠ztri.com.cn