曹 慧，陳小珍，王 瑾，陳萬勤

（浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013）

同位素稀釋－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析嬰兒配方奶粉中的維生素D

曹 慧，陳小珍，王 瑾，陳萬勤

（浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013）

為了準(zhǔn)確測定嬰兒配方奶粉中維生素D的含量，建立了同位素稀釋－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析維生素D含量的方法。樣品經(jīng)氫氧化鉀皂化，用V（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液提取，采用Waters T3色譜柱分離，以2mmol／L甲酸銨－甲醇和2mmol／L甲酸銨－水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧－正離子電離源多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定性和定量分析，內(nèi)標(biāo)法定量。維生素D2和維生素D3在5～150μg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，維生素D2和維生素D3的檢出限均為1.5μg／kg，定量限均為5.0 μg／kg，方法回收率分別為97.0%～104.7%和92.7%～108.0%，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。該方法簡單、靈敏度高、分析時間短、定量準(zhǔn)確，適用于嬰兒奶粉中維生素D的測定。

同位素稀釋；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；維生素D；嬰兒配方奶粉

維生素D為固醇類衍生物，具有抗佝僂病的作用，是一種重要的脂溶性維生素［1－3］。維生素D對于人體健康有諸多益處，除了可保持骨骼強健、預(yù)防軟骨病外，還能起到有效治療軟骨病的功效。最新醫(yī)學(xué)研究表明，童年時保證攝入足夠的維生素D能降低成年后患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。維生素D家族成員中最重要的成員是維生素D2和D3，由于它們結(jié)構(gòu)相似、功能相同、色譜行為相近，對其進(jìn)行有效分離和定量具有一定的難度。目前，對于維生素D的檢測主要采用高效液相色譜法［4－10］，由于樣品中維生素D含量低，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，很難對維生素D進(jìn)行準(zhǔn)確地定性和定量。有報道采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的維生素D［11－18］，由于皂化和液液萃取等過程導(dǎo)致目標(biāo)分析物不同程度的損失，基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析中表現(xiàn)明顯，因而，很難對維生素D進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

本工作采用同位素稀釋－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對嬰幼兒配方奶粉中的維生素D進(jìn)行分析測定，在試驗中加入同位素內(nèi)標(biāo)，避免由于皂化和萃取過程導(dǎo)致的目標(biāo)物損失，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，消除基質(zhì)效應(yīng)的影響［19－21］。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

AcquityTM超高效液相色譜儀和XevoTMTQ－MS質(zhì)譜儀：美國 Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離接口（ESI）及 Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli－Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機：美國Thermo公司產(chǎn)品；氮氣吹干儀：天津市恒奧科技有限公司產(chǎn)品；往復(fù)式恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；渦旋混合器：太倉市華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈：色譜純，德國Meker公司產(chǎn)品；異辛烷、乙醚、正戊烷：色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；嬰兒配方奶粉：市售品；維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品：美國pharmacopeia公司產(chǎn)品；維生素 D2－2H3（1mg）和維生素 D3－2H3（1g／L，1 mL）標(biāo)準(zhǔn)品：美國IsoSciences LLC公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10mg維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用異辛烷定容，配置成1g／L的儲備液，密封儲存于－20℃冰箱中。分別吸取1g／L的維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL于50mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用時稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：取1mg維生素D2－2H3標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用異辛烷定容，配置成100mg／L的儲備液，密封儲存于－20℃冰箱中。取1mL濃度為1g／L的維生素D3－2H3標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用異辛烷定容，配置成100mg／L的儲備液，密封儲存于－20℃冰箱中。分別吸取100mg／L的維生素D2－2H3和維生素D3－2H3標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1mg／L的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱2.1mm×100mm，粒徑1.8 μm；柱溫：35℃；樣品溫度：25℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3mL／min；流動相：2mmol／L甲酸銨甲醇（A），2mmol／L甲酸銨水混合溶液（B）；洗脫程序：0～1min，95%A，3～6min，100%A，7～10min，95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.00kV；錐孔電壓：20V；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000L／h。

1.4 前處理方法

稱取2g試樣于離心管中，加入100μL濃度為1mg／L的混合內(nèi)標(biāo)溶液、0.4g抗壞血酸和10mL水，渦旋混合均勻，再加入6mL甲醇和5mL 45%的氫氧化鉀溶液，置于75℃水浴中，振搖皂化30min后轉(zhuǎn)移入分液漏斗，用22 mLV（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液和6mL乙腈萃取，有機相經(jīng)水洗至中性，在40℃下氮氣吹至干，加入2mLV（甲醇）∶V（水）＝95∶5的混合溶液溶解。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別選取5種不同長度、不同型號的色譜柱分離維生素D2和維生素D3，使用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對各規(guī)格色譜柱進(jìn)樣分離得色譜質(zhì)譜圖，其中Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1mm×100 mm，1.8μm）的峰形和分離效果最好，這是由于T3色譜柱可以提高極性化合物的保留并與純水相流動相兼容，使峰形對稱且穩(wěn)定。Waters Acquity UPLC BEH Hilic（2.1mm×100mm，1.7 μm）色譜柱要求高比例有機相，水相比例極小，不適合維生素D類物質(zhì)的分析。Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色譜柱由于長度太短，干擾嚴(yán)重，且維生素D2和維生素D3不能有效分離。Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）和Waters Acquity UPLC BEH C8（2.1mm×100 mm，1.7μm）色譜柱由于不能完全兼容純水相流動相，峰形拖尾較嚴(yán)重且分離效果不好。

選取 Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100mm，1.8μm）色譜柱，分別選擇甲醇和乙腈作為強洗脫流動相。試驗證明：當(dāng)乙腈作流動相時，離子化受到不同程度的抑制，豐度明顯降低，導(dǎo)致靈敏度下降，而甲醇的離子化效率明顯優(yōu)于乙腈，故本試驗采用甲醇強洗脫流動相。在流動相中加入甲酸銨能增加維生素D2和維生素D3在ESI＋模式下的離子化效率。本試驗分別配制1、2和5mmol／L的甲酸銨－甲醇和甲酸銨－水作為流動相，試驗表明，2mmol／L的甲酸銨體系能提供最佳離子化條件，峰面積信號最強，靈敏度最高。圖1為維生素D2和維生素D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧質(zhì)譜、正離子監(jiān)測模式下，分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進(jìn)行了充分的優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的兩個子離子作為定量和定性離子，并確定其最佳碰撞能量的電壓值。最終所選擇確定的母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)列于表1。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

采用V（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液作為萃取溶劑，與乙醚或石油醚相比，具有提取效率高、回收穩(wěn)定等優(yōu)點；在萃取試劑中加入乙腈溶液，有利于萃取后兩相分層，不利于乳化。在前處理過程中加入了同位素內(nèi)標(biāo)，避免了由于多次液液萃取造成的損失，提高了定量分析的準(zhǔn)確性。

圖1 維生素D2和維生素D3的MRM色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of vitamin D2and vitamin D3

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍和檢出限 取濃度分別為5、10、25、50、100、125、150μg／L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，示于圖2，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明：維生素D2和維生素D3在5～150μg／L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均在0.999以上。按3倍信噪比計算得到樣品中維生素D2和維生素D3的檢出限為1.5μg／kg，定量限為5.0μg／kg。

2.4.2 精密度和穩(wěn)定性實驗 在不含有維生素D2和D3的奶粉樣品基質(zhì)中添加20μg／kg濃度水平的維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法進(jìn)行預(yù)處理，平行操作7次，進(jìn)行分析，維生素D2和維生素D3的RSD分別為1.07%和0.77%。按日內(nèi)精密度的預(yù)處理方法，每天取樣1份，連續(xù)測定7天，維生素D2和維生素D3的RSD分別為6.82%和5.63%，該試驗重現(xiàn)性較好。

2.4.3 回收率實驗 分別在不含有維生素D2和D3的奶粉樣品基質(zhì)中添加5、10、20和100 μg／kg 4種不同濃度的維生素D2和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法進(jìn)行預(yù)處理，回收率列于表3。結(jié)果表明：維生素D2的回收率在97.0%～104.7%，維生素 D3的回收率在92.7%～108.0%。

圖2 維生素D2和維生素D3的校正曲線Fig.2 Calibration curve of vitamin D2and vitamin D3

2.5 實際樣品的測定

對市場上3批嬰兒配方奶粉，根據(jù)1.4方法進(jìn)行測定，每批平行測定3次，結(jié)果列于表4。

表2 維生素D2和維生素D3的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，LOD and LOQ of vitamin D2and vitamin D3

表3 維生素D2和維生素D3的回收率結(jié)果（n＝3）Table 3 Results of recoveries of vitamin D2and vitamin D3

表4 維生素D2和維生素D3的測定結(jié)果Table 4 Testing results of vitamin D2and vitamin D3

3 結(jié) 論

本工作建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰兒配方奶粉中的維生素D2和維生素D3含量。該方法具有靈敏度高、前處理方法簡單、回收率高且穩(wěn)定、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點，由于在前處理方法中加入了同位素內(nèi)標(biāo)，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，樣品消耗量少，萃取效率高，能有效地去除基質(zhì)干擾，定量結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。

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Determination of Vitamin D in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry with Isotopes Dilution

CAO Hui，CHEN Xiao－zhen，WANG Jin，CHEN Wan－qin
（Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou310013，China）

In order to establish a reliable method for quantitative analysis of vitamin D in infant milk powder，a ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC／MS／MS）with isotopes dilution method was developed.The samples were saponifed with KOH and extracted by pentane－ethyl ether solution（V（pentane）∶V（ethyl ether）＝4∶1）.The target analytes were separated on the Waters T3column with gradient elution using methanol and water（containing 2mmol／L ammonium formate for both）as mobile phase.The identification and quantification were achieved by using electrospray ionization in positive ion mode and with multiple reaction monitoring.Internal standard method was used to determine the results.The linear range of the calibration curve was 5—150μg／L.The limit of detection（LOD）of the method was 1.5μg／kg，and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0μg／kg.The recoveries of the method were in the range of 97.0%—104.7%and 92.7%—108.0%for vitamin D2and vitamin D3respectively.The relative standard deviations（RSD）of intra－day and inter－day were less than 10%.The simply，rapid，accurate and sensitive method can be applied to determine the vitamin D in infant milk powder.

isotopes dilution；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）；vitamin D；infant milk powder

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0232－05

2012－04－09；

2012－06－03

浙江省科技廳分析測試科技計劃（2011C37072）、浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計劃（20110203）項目資助

曹 慧（1980～），女（漢），浙江湖州人，博士，工程師，主要從事色譜和質(zhì)譜檢測與科研工作。E－mail：ch＿zj＿cn＠163.com

陳小珍（1960～），女（漢），浙江杭州人，教授級高級工程師，主要從事食品檢測與研究工作。E－mail：cxz730＠163.com