鄭 重，宋鳳瑞，劉 舒，趙先恩，劉志強(qiáng)，劉淑瑩

（1.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

Semi－LC／MS技術(shù)快速定量分析黃芪樣品中黃芪甲苷含量

鄭 重1，2，宋鳳瑞1，劉 舒1，2，趙先恩1，劉志強(qiáng)1，劉淑瑩1

（1.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

為了測定黃芪中的黃芪甲苷含量，應(yīng)用半高效液相色譜－質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（Semi－LC／MS），以薯蕷皂苷為內(nèi)標(biāo)化合物，僅用一段色譜保護(hù)柱分離掉大部分干擾性成分，同時(shí)使目標(biāo)化合物富集，采用Waters公司的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式檢測。結(jié)果表明：黃芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD＜3%，樣品回收率達(dá)98.9%。Semi－LC／MS方法可以對黃芪樣品中黃芪甲苷進(jìn)行快速定量分析，是一種黃芪甲苷的簡單、高效、靈敏的定量檢測方法。

黃芪甲苷；半高效液相色譜－質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（Semi－LC／MS）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定量分析

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao、膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）的根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效［1］，含皂甙、多糖、多種氨基酸及硒、鋅、銅等多種微量元素。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分，是其質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。黃芪甲苷的分析方法已有比色法、熒光分光光度法、薄層掃描法、HPLC 法（含 UPLC 法）、HPLC－MS法等［2－9］。其中比色 法、薄層掃描法存在定量不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)；熒光分光光度法實(shí)驗(yàn)條件苛刻，對實(shí)驗(yàn)者操作技能要求較高；由于黃芪甲苷吸收波長在200nm左右，給常規(guī)HPLC分析帶來挑戰(zhàn)；目前高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）法是較為常用的黃芪甲苷的測定方法，但其檢測靈敏度受到蒸發(fā)光檢測器的制約，不適合微量樣品分析。本工作采用半高效液相色譜－質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（Semi－LC／MS）測定黃芪中的黃芪甲苷含量，優(yōu)化檢測條件，旨在建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的黃芪甲苷的定量檢測方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity Ultra Performance LC系統(tǒng)：美國Waters公司產(chǎn)品；XEVO－TQ三重四極桿質(zhì)譜：美國Waters公司產(chǎn)品，配有 Waters Masslynx V4.1數(shù)據(jù)工作站。

1.2 主要材料與試劑

黃芪甲苷對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110781200613，供含量測定用；薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；黃芪藥材：購自北京同仁堂藥店、吉林大藥房、益和大藥房；乙腈：美國Fisher公司產(chǎn)品，色譜純；甲醇、正丁醇、氨水：分析純，均為北京化工廠產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18柱（2.5μm，4.6×20mm）；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（水）＝55∶45的混合溶液；流速：0.7mL／min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：3μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 以薯蕷皂苷為內(nèi)標(biāo)化合物，負(fù)離子模式檢測，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式定量，毛細(xì)管電壓2.50kV，離子源溫度350℃，脫溶劑氣體流速800L／h，錐孔氣流速50L／h，碰撞氣流速0.15mL／min，得到的質(zhì)譜圖示于圖1。

1.4 對照品儲備液的制備

圖1 質(zhì)譜總離子流圖（a）、黃芪甲苷MRM離子流圖（b）和薯蕷皂苷MRM離子流圖（c）Fig.1 Total ion current chromatogram（a），MRM spectrum of Astragaloside（b）and MRM spectrum of Dioscin（c）

準(zhǔn)確稱取黃芪甲苷對照品5.70mg，以甲醇溶解，并定容到10mL容量瓶中，搖勻，即得0.570g／L的黃芪甲苷對照品溶液。準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10.01mg，以甲醇溶解，并定容于10mL容量瓶中，搖勻，即得1.00g／L薯蕷皂苷對照品溶液。

1.5 樣品溶液的制備

取黃芪藥材粉末4.089 2g，置索氏提取器中，加甲醇40mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4h，提取液回收溶劑并濃縮至干，加水10mL，微熱使殘?jiān)芙猓盟柡偷恼〈颊駬u提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，加水5mL使殘?jiān)芙猓爬?，通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑1.5cm，長12cm），以50mL水洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得待測樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別采用電噴霧正離子模式與負(fù)離子模式對黃芪甲苷與薯蕷皂苷進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下兩者均有很好的質(zhì)譜信號響應(yīng)，所以最終確定采用負(fù)離子模式對這兩種化合物進(jìn)行分析，并對其MRM條件進(jìn)行了優(yōu)化，其結(jié)果列于表1。選擇其中信號最強(qiáng)的離子對進(jìn)行定量測定。

表1 黃芪甲苷與薯蕷皂苷的MRM質(zhì)譜條件Table 1 The MRM conditions ofAstragalosideandDioscin

2.2 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取濃度為2.85、5.70、11.4、14.25、28.5、42.75、57.0mg／L的黃芪甲苷對照品溶液（含0.50mg／L的薯蕷皂苷對照品內(nèi)標(biāo)），按1.3色譜、質(zhì)譜條件測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），黃芪甲苷峰面積與薯蕷皂苷峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）繪制校準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為y＝0.011 5x＋0.013 6，r2＝0.991 3，樣本含量n＝7，F(xiàn)＝661，黃芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性曲線示于圖2。

圖2 黃芪甲苷線性曲線Fig.2 The standard curve of Astragaloside

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取所制備的黃芪樣品溶液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，定容于1mL容量瓶中，分別在0、2、4、8、12、24h測定黃芪甲苷的峰面積與薯蕷皂苷峰面積，計(jì)算峰面積比值的RSD為2.12%。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品按1.5項(xiàng)方法制備6份樣品溶液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，定容于1mL容量瓶中，分別進(jìn)樣，測定黃芪甲苷峰面積與薯蕷皂苷峰面積，計(jì)算黃芪甲苷含量，RSD為2.41%。

2.5 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量（0.638mg／g）的黃芪藥材，共6份，分別準(zhǔn)確加入黃芪甲苷對照品溶液（含黃芪甲苷1.425mg），按1.5項(xiàng)方法制備供試液，稀釋5倍后，取200μL，加入50μL薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，定容于1mL容量瓶中，測定并計(jì)算平均回收率為98.9%，RSD為1.77%。

2.6 樣品含量測定

采用1.5項(xiàng)方法，對不同批次的黃芪藥材進(jìn)行處理，用1.3項(xiàng)色譜、質(zhì)譜方法進(jìn)行測定，各樣品中的黃芪甲苷的含量測定結(jié)果列于表2。

表2 黃芪中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果（mg／g）Table 2 Content ofAstragalosideinAstragalusSamples（mg／g）

2.7 結(jié)果討論

由于質(zhì)譜檢測器的高靈敏度，使得LC／MS技術(shù)在藥物定性定量分析領(lǐng)域有廣泛的用途［10－14］。但是由于常規(guī) HPLC消耗時(shí)間長，質(zhì)譜檢測器的信號穩(wěn)定性不如紫外等常規(guī)檢測器，中藥復(fù)雜體系干擾因素較多，來自于溶劑中的噪音對信號產(chǎn)生干擾，這些都制約著LC／MS技術(shù)應(yīng)用于藥物定量領(lǐng)域的發(fā)展。本試驗(yàn)采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式［15－21］，以母離子－子離子反應(yīng)通道作為定量手段，能夠有效的排除存在于提取物中非目標(biāo)化合物的干擾，因皂苷類成分在負(fù)離子模式下信噪比較高，而且碎裂能量低，故本試驗(yàn)采用負(fù)離子模式檢測。試驗(yàn)中曾經(jīng)嘗試從自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，不經(jīng)過任何色譜柱，直接對待測樣品進(jìn)行MRM分析，但由于提取物含有復(fù)雜的干擾性成分，在離子化過程中存在電離競爭反應(yīng)，導(dǎo)致目標(biāo)化合物離子化效率不高且重現(xiàn)性差；并且從進(jìn)樣開始樣品在流路中一直處于擴(kuò)散狀態(tài)，導(dǎo)致色譜峰型展寬，影響定量重現(xiàn)性；因此從信噪比、峰型、定量效果等方面都不能得到滿意的結(jié)果，于是采取了連接一段保護(hù)柱（Waters XBridge C18柱，2.5μm，4.6×20mm）的方案，能夠分離掉大部分干擾性成分，同時(shí)能夠使目標(biāo)化合物達(dá)到富集效果。試驗(yàn)中引入薯蕷皂苷作為內(nèi)標(biāo)化合物，進(jìn)一步提升了定量穩(wěn)定性，得到了令人滿意的效果。雖然采用了Waters XBridge C182.5μm，4.6×20mm色譜柱，但是其作用僅僅為目標(biāo)物富集與干擾物分離，并不需要高性能色譜柱來實(shí)現(xiàn)分離，同時(shí)與常規(guī)LC不同，目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)化合物出峰時(shí)間均在1min之內(nèi)，檢測時(shí)間可與UPLC相媲美。

3 結(jié) 論

采用Semi－LC／MS技術(shù)，多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了黃芪藥材中黃芪甲苷的快速、準(zhǔn)確、高靈敏的分析方法。Semi－LC法與常規(guī)HPLC法相比，能夠顯著提高分析效率、節(jié)省分析時(shí)間、減少溶劑損耗，并且質(zhì)譜（MRM模式）優(yōu)秀的選擇性，能避免實(shí)際分析中的假陽性結(jié)果。

［1］ 中華人民共和國藥典委員會編.中國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010，一部，283－284.

［2］ 李永吉，管慶霞，關(guān)延彬，等.HPLC與比色法測定復(fù)方黃芪注射液中總皂苷與黃芪甲苷含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2004，17（1）：1－3.

［3］ 杜 鳴，劉養(yǎng)清，嚴(yán) 志，等.茴香酸熒光分析法測定血清中黃芪甲甙［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2001，33（3）：274－276.

［4］ 張崇禧，王艷芳，蔡恩博，等.薄層掃描法分析黃芪中黃芪甲苷含量［J］.資源開發(fā)與市場，2010，26（9）：769－772.

［5］ 馬艷蓉，劉 泓，柴國林，等.HPLC－ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量及相關(guān)試驗(yàn)條件選擇的探討［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17（6）：17－19.

［6］ 楊 俊，王文輝，王 齊，等.UPLC－ELSD法測定黃芪中的黃芪甲苷含量［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2009，26（3）：484－486.

［7］ 王鐸，盛龍生，宋 越，等.HPLC－MS法測定步長腦心通中多種黃芪皂苷類成分［J］.中國天然藥物，2006，4（4）：287－290.

［8］ 劉浩文，劉嘉儀，楊妙榮，等.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（6）：659－662.

［9］ 歐陽春華.黃芪甲苷含量測定幾種常用方法的比較，黃芪甲苷含量測定幾種常用方法的比較［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥應(yīng)用，2009，3（15）：139－141.

［10］ STAHNKE H，REEMTSMA T，ALDER L.Compensation of matrix effects by postcolumn infusion of a monitor substance in multiresidue，analysis with LC－MS／MS［J］.Analytical Chemistry，2009，81（6）：2 185－2 192.

［11］ TOKMANA N，SOLERA C，MARINEL F，et al.Determination of amitraz and its transformation products in pears by ethyl acetate extraction and liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2009，3 138－3 145.

［12］ CRISTIANA C，LEANDRO ，HANCOCK P，et al.Comparison of ultra－performance liquid chromatography andhigh－performance liquid chromatography for the determination of priority pesticides in baby foods by tandem quadrupole mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，94－101.

［13］ BRIAN K，STEVEN J.LEHOTAY，et al.New method for the analysis of flukicide and other anthelmintic residues in bovine milk and liver using liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2009，196－207.

［14］ 單鳴秋，錢 雯，高 靜，等.UPLC－MS分析側(cè)柏葉中黃酮類化合物［J］，中國中藥雜志，2011，36（12）：1 626－1 629.

［15］ 朱瑞芝，王 凱，吳新華，等.超高效液相色譜－質(zhì)譜法同時(shí)快速測定煙葉中的幾種芳香酸和酚酸［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2009，28（10）：108－112.

［16］ 張 健，桂 新，章蘇寧，等.甜茶葉中甜茶苷的UPLC－MS／MS分析［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（5）：2 692－2 696.

［17］ 李水軍，劉罡一，印其友，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中15種膽汁酸［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2007，26（3）：315－318.

［18］ 廖文娟，張 虹，任一平.液相色譜－串聯(lián)四級桿質(zhì)譜測定罌粟殼主要成分在止咳藥中的含量［J］.分析化學(xué)，2006，34（8）：1 175－1 178.

［19］ 嚴(yán)忠紅，李 林，汪國權(quán)，等.UPLC－MS／MS測定人源Caco－2細(xì)胞中人參炔醇的含量［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，31（10）：1 370－1 374.

［20］ 李 欣，王步軍.超高效液相色譜－串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定苦蕎麥中黃酮類化合物［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（4）：383－385.

［21］ 劉永福，賈小芳，騰珍林，等.液質(zhì)聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測法定量目標(biāo)多肽或蛋白質(zhì)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（1）：86－92.

Rapid Quantitative Analysis of Astragalosidein the Astragalus Samples by Semi－LC／MS

ZHENG Zhong1，2，SONG Feng－rui1，LIU Shu1，2，ZHAO Xian－en1，LIU Zhi－qiang1，LIU Shu－ying1
（1.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Science，Changchun130022，China；2.Graduate School of Chinese Academy of Science，Beijing100049，China）

In order to determinate the astragaloside in the astragalus by Semi－LC／MS，diosgenin is used as an internal standard compound，a chromatography guard column was used to remove most interference components and enrich the target compound which was subsequently determined by MS under multiple reaction monitoring（MRM）scanning－mode.The calibration curve is linear over the range of 2.85—57.0mg／L of astragaloside.The RSDs for the stability and reproducibility experiments are less than 3%，and sample recovery rate is 98.9%.Semi－LC／MS is one simple，efficient，sensitive method for rapid quantitative analysis of astragaloside in astragalus samples.

Astragaloside；semi－h(huán)igh performance liquid chromatography－mass spectrometry（Semi－LC／MS）；multiple reaction monitoring（MRM）；quantitative analysis

O657.63

A

1004－2997（2012）04－0208－04

2012－03－31

2012－06－13

國家自然科學(xué)基金 （20953001）、吉林省與中國科學(xué)院科技合作資金（2010SYHZ0052，2011CJT0015）項(xiàng)目資助

鄭 重（1978～），男（漢），吉林省長春人，助理研究員，從事天然藥物化學(xué)與有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E－mail：zhengzh＠ciac.jl.cn

劉志強(qiáng)（1962～），男（漢），研究員，從事天然藥物化學(xué)與有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E－mail：liuzq＠ciac.jl.cn