宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽(yáng) 110004)

黃芪對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽(yáng) 110004)

［目的］體外觀察黃芪對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Hep-2的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用并探討其作用機(jī)制。［方法］用20、100、200 μg/mL的黃芪作用于Hep-2細(xì)胞24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率，共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡，Western Blot檢測(cè)Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達(dá)。［結(jié)果］黃芪對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性;隨著黃芪濃度增高，處于G2/M期細(xì)胞的比例逐漸升高，同時(shí)伴有G0/G1期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，各實(shí)驗(yàn)組之間及其與對(duì)照組之間的差異均有顯著性意義(P＜0.05);熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)典型細(xì)胞凋亡;Western Blot檢測(cè)顯示黃芪可劑量依賴性抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達(dá)。［結(jié)論］黃芪可通過(guò)抑制Bcl-2和Cyclin B1的蛋白表達(dá)，引起喉癌細(xì)胞G2/M期阻滯，抑制增殖和凋亡，發(fā)揮抗癌作用。

黃芪;喉癌;凋亡

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來(lái)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。喉癌總的生存率很低，因此，人們一直在不斷地尋求有效的治療方式，其中之一就是尋找新的、高效、低毒的抗腫瘤藥物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，黃芪中黃酮成分黃芪素，通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。本文探討不同濃度黃芪對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，為進(jìn)一步闡明黃芪的抗喉癌機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株:喉鱗狀細(xì)胞癌hep-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。試劑:黃芪注射液購(gòu)自正大青春寶集團(tuán)，核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)，MTT，碘化丙啶(proidum iodide，PI)，二甲基亞楓(dimethyI，sulfoxide，DMSO)等均購(gòu)自 Sigma公司;Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司;CCK8和OECHST33258，CyclinB1，Bcl-2抗體購(gòu)于上海生工;TMPI-1640培養(yǎng)液由Gibco生產(chǎn);標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，胰蛋白酶，青鏈霉素，磷酸鹽緩沖溶液(phophate buffered saline，PBS)購(gòu)自上海生工生物有限公司。儀器:FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)，Becto Dickinson公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)(日本，SANYO公司)，SW-CJ-1B型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，至生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

Hep-2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/mL，以5×103/孔的密度接種細(xì)胞于96孔板，接種后第2天加入不同濃度黃芪(20，100，200 μg/mL)的培養(yǎng)液，對(duì)照組加等體積 RPMI 1640，每組3個(gè)復(fù)孔。分別于藥物作用24 h后加入CCK8 試劑10 μL，37℃反應(yīng)2 h，450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(A)。

按公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞按濃度1×107個(gè)/瓶接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，換成含有不同濃度的黃芪(20，100，200 μg/mL)的培養(yǎng)液，繼續(xù)作用24 h，收集細(xì)胞，PBS洗2次，70%冰乙醇4℃下固定，加入RNase溶液，上機(jī)前加入PI遮光染色30 min，PBS洗2次，過(guò)100目網(wǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個(gè)/L，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 熒光顯微鏡觀察凋亡

將預(yù)處理過(guò)的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，Hep-2細(xì)胞(5×105/孔)接種過(guò)夜，分為正常對(duì)照組與給藥組，給藥組加入200 μg/mL的黃芪培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，用吹風(fēng)機(jī)(冷風(fēng))吹干玻片，固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS洗1次，加Hoechst 33258熒光染料(1 mL)，37℃避光孵育20 min，含1%甘油的PBS封片，于熒光顯微鏡下觀察，照相。

1.6 Western Blot分析

將喉癌細(xì)胞分 4 組分別加(20，100，200 μg/mL)不同濃度黃芪及培養(yǎng)基作用喉癌Hep-2細(xì)胞24 h后，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，然后加細(xì)胞裂解液冰上放置20 min，12000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入1∶500稀釋的兔抗人Bcl-2，CyclinB1 單克隆抗體，室溫孵育 3 h，TBS 洗滌后加入稀釋度1∶4000的二抗，室溫孵育90 min;TBS洗滌后經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑孵育，發(fā)光，顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍后采用ECL檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)用GENE TOOLS軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均采用±s表示，兩組之間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，3組以上樣本間關(guān)系采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

藥物作用24 h 后，20 μg/mL、100 μg/mL 與200 μg/mL黃芪組抑制率分別為(35.38±0.17)%、(59.12 ±0.21)%和(84.55 ±0.27)%，各組比較差異均有顯著性意義，P＜0.05。

2.2 黃芪對(duì)Hep-2細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的影響

檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的黃芪分別作用Hep-2細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，S期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，阻滯在G2/M期，且差異均有顯著性意義(P＜0.05);隨著黃芪濃度的增加，阻滯作用呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度黃芪作用24 h后細(xì)胞各周期分布Fig 1 Flow cytometry analysis cell cycle distribution in different concentrations of Astragalus groups

2.3 黃芪作用Hep-2細(xì)胞24 h后形態(tài)學(xué)變化

Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察，200 μg/mL黃芪作用于Hep-2細(xì)胞24 h細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著性改變，呈現(xiàn)染色質(zhì)邊集，核固縮，核片斷化，核碎裂溶解。隨著黃芪濃度增加，凋亡的細(xì)胞明顯增多，甚至出現(xiàn)大片細(xì)胞脫落形成細(xì)胞脫失區(qū)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和Cyclin B1表達(dá)情況

分別用20，100，200 μg/mL 黃芪處理細(xì)胞 24 h后，cyclin B1和Bcl-2后蛋白表達(dá)下降，隨濃度增加而明顯下降，見(jiàn)表1、圖3。

圖2 Hoechst33258觀察黃芪作用Hep-2細(xì)胞24 h后形態(tài)學(xué)變化Fig 2 Observe Hep-2 cell apoptosis with Astragalus treating by Hoechst 33258 staining

表1 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表達(dá)的變化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

表1 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和CyclinB1蛋白表達(dá)的變化Tab 1 Protein expression of Bcl-2 and Cyclin B1(±s)

與對(duì)照組比較，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

Bcl-2 Cyclin B1對(duì)照組1.15 ±0.08 0.97 ±0.24黃芪 20 μg/mL 組 0.74 ±0.071) 0.64 ±0.122)黃芪 100 μg/mL 組 0.26 ±0.041) 0.43 ±0.191)黃芪 200 μg/mL 組 0.13 ±0.021) 0.15 ±0.031)

圖3 不同濃度黃芪作用后Bcl-2和Cyclin B1蛋白表達(dá)情況Fig 3 Protein Expression of Bcl-2 and Cyclin B1 with Astragalus treating by Western blot assay

3 討論

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，是東北地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，大約占所有新發(fā)惡性腫瘤的1%，其中90%以上是喉鱗狀細(xì)胞癌。目前，在放化療和外科手術(shù)聯(lián)合治療的情況下，Tis、T1及T2期喉癌治療有效率在80%～90%左右，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。盡管外科手術(shù)和放化療技術(shù)有了明顯進(jìn)步，但患者的5年生存率仍沒(méi)有提高，原因是多方面的，其中對(duì)發(fā)病機(jī)制研究不夠完善、沒(méi)有明確的治療靶點(diǎn)是最關(guān)鍵的。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，黃芪中黃酮成分黃芪素，通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。Roy等［1］發(fā)現(xiàn)用小劑量黃芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60細(xì)胞大量停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芪素則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chao等［2］研究發(fā)現(xiàn)黃芪素可使膀胱癌細(xì)胞停滯于G2/M 期。Leung等［3］用50 μmol/L黃芪素培養(yǎng)人非小細(xì)胞性肺癌H460細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase，CDK1)和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)B1蛋白表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致S期生長(zhǎng)停滯，阻止細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有抑制喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡的作用。其作用機(jī)制可能和黃芪調(diào)控Bcl-2，Cyclin B1凋亡相關(guān)基因有關(guān)。

本研究通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃芪對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。抑制率曲線隨濃度增加而逐漸上升，到200 μg/mL時(shí)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑瘤效果，由此推斷黃芪可以在體內(nèi)外發(fā)揮對(duì)喉癌的抑制作用。

通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)不同濃度的黃芪作用于Hep-2細(xì)胞后引起的細(xì)胞周期停頓，細(xì)胞大量停滯于G2/M期，說(shuō)明黃芪可通過(guò)阻止細(xì)胞進(jìn)入S期生長(zhǎng)來(lái)誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡。

凋亡是在基因的調(diào)控下進(jìn)行的，相關(guān)基因分為促凋亡基因、抑制凋亡基因和凋亡過(guò)程表達(dá)基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，黃芪素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與影響上述基因蛋白的表達(dá)有關(guān)。凋亡抑制蛋白家族(IAP)研究顯示黃芪素誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯和凋亡的可能機(jī)制是通過(guò)CDC2-survivin通路，即黃芪素顯著降低腫瘤細(xì)胞cyclin B1的表達(dá)，CDC2磷酸化和survivin的表達(dá)，從而抑制p38-MAPK和AKT的磷酸化激活［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在喉癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)顯示隨著黃芪作用濃度增大cyclinB1和Bcl-2蛋白表達(dá)下降，且隨濃度增加而明顯下降。說(shuō)明黃芪可通過(guò)抑制細(xì)胞周期調(diào)控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)起到促凋亡作用。

本研究首次證明黃芪能夠誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并有效抑制Hep-2細(xì)胞的活性。黃芪對(duì)Hep-2細(xì)胞的抑制作用在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。黃芪可以通過(guò)調(diào)節(jié)cyclin B1和Bcl-2來(lái)抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，在未來(lái)喉癌的治療中，黃芪有著廣闊的應(yīng)用前景。

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［1］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149 -153.

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Effects of astragalus on cell proliferation and apoptosis in Hep-2 cells in vitro

SONG Yan，LIU Xiu-ping，BAI Wei-liang，JI Wen-yue
(Department of Otolaryngology，Sheng-Jing Hospital，China Medical University，Shenyang110004，China)

Abstract:［Objective］To investigate the mechanism underlying the anticancer activity of Astragalus on human laryngeal cancer.［Method］Hep -2 cells were treated with astragalus in different concentrations for 24 h.MTT assay was used to evaluate cell proliferation.Flow cytometry with PI staining and fluorescent microscopy with Hoechst 33258 staining were used to estimate cell cycle distribution and apoptosis.Expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were evaluated by western blot.［Result］Astragalus inhibited cellular proliferation in a dose dependent manner(P＜ 0.05).Flowcytometry analysis showed that treatment with astragalus resulted in accumulation cells at the G2/M phase of the cell cycle and cell apoptosis in a dose dependent manner(P＜0.05).Marked morphological changes of cell apoptosis including condensation of chromatin，nuclear fragmentation and apoptotic bodies were observed clearly by Hoechst 33258 staining.Western blot analysis demonstrated that the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1 were suppressed significantly.［Conclusion］Astragalus inhibited Hep-2 cells proliferation and induced them apoptosis by down regulating the expressions of Bcl-2 and Cyclin B1.

Key words:astragalus;laryngeal carcinoma;apoptosis

R735.7

A

1671-7295(2012)05-0432-04

遼寧省自然科學(xué)基金(20082105)

2012-06-04;

2012-09-03

宋 巖(1982-)，女，遼寧沈陽(yáng)人，博士。E-mail:songy1@sj-hospital.org

季文樾，主任醫(yī)師。E-mail:jiwy@sj-hospital.org