羅心靜，莫選榮，周玲玲

(臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，浙江臺(tái)州318000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病。炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)是導(dǎo)致RA滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞的重要因素。而在炎性介質(zhì)的表達(dá)調(diào)節(jié)中，核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor κB，NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1，AP-1)被認(rèn)為是最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，它們的表達(dá)和活性增加可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的生成［1－2］。本研究觀察了膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠滑膜中 NF-κB 和 AP-1表達(dá)及活性變化，以探討RA病變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物:清潔級(jí)雄性DBA/1小鼠20只，年齡8～10周(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，正常飼養(yǎng)。

1.2 試劑:牛II型膠原(Chondrex公司);完全福氏佐劑(CFA)或不完全福氏佐劑(FIA)(Sigma公司);TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(博士德公司);抗AP-1(fos)抗體和抗NF-κB(P65)抗體(Cell signal公司);電泳遷移率分析(EMSA)試劑盒(Pierce公司);AP-1寡核苷酸探針(5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3')、NF-κB 寡核苷酸探針(5'-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3')由上海英俊公司合成。

1.3 分組和造模:將小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和CIA模型實(shí)驗(yàn)組。CIA模型制備參照文獻(xiàn)［3］。初次免疫30 d后處死小鼠，心臟取血，分離血清，并取左后足跖趾關(guān)節(jié)連續(xù)冰凍切片。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè):小鼠血清中 TNF-α、IL-6的含量用ELISA法檢測(cè)，具體操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 免疫組化法檢測(cè)NF-κB和AP-1表達(dá):石蠟切片脫蠟水化;蒸餾水沖洗后于3%H2O2孵育10 min，PBS洗后微波法修復(fù)抗原，滴加封閉血清，室溫孵育20 min;滴加適當(dāng)稀釋抗NF-KB(P65)或抗AP-1(fos)抗體，37℃孵育2 h;PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育15 min;PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min;PBS沖洗后滴加DBA顯色。沖洗后蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。圖片分析儀進(jìn)行圖片分析，測(cè)定平均吸光度值。

1.6 EMSA檢測(cè)NF-κB和AP-1的活性:分離滑膜組織核蛋白，按Pierce公司試劑盒說明書檢測(cè)NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 13.0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中TNF-α和IL-6表達(dá)水平的檢測(cè):CIA小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯高于對(duì)照組［(750.5±45.6)ng/L vs(203.6±32.3)ng/L和(93.1±8.8)ng/L vs(26.8±5.2)ng/L］(P ＜0.05)。

2.2 滑膜組織中AP-1和NF-κB表達(dá)的檢測(cè):CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜中NF-κB陽性染色程度明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組(P＜0.05);AP-1陽性染色程度也明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組(P＜0.05);陽性細(xì)胞分布于滑膜襯里層，胞質(zhì)及胞核內(nèi)均有染色，但胞核染色較深(圖1，表1)。

表1 CIA小鼠和正常對(duì)照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表達(dá)Table 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(x ± s，n=10)

2.3 滑膜組織中AP-1和NF-κB的活性檢測(cè):CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜中 NF-КB DNA結(jié)合活性明顯高于正常對(duì)照組，AP-1 DNA結(jié)合活性也顯著高于正常對(duì)照組(圖2)。

圖1 CIA小鼠和正常對(duì)照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表達(dá)Fig 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(SP，×400)

圖2 CIA小鼠和正常對(duì)照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的DNA結(jié)合活性Fig 2 The DNA binding activity of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice

3 討論

炎性細(xì)胞因子在RA發(fā)病機(jī)制中起了重要作用，是使RA病變持續(xù)存在、遷延進(jìn)展的關(guān)鍵因素。在RA的關(guān)節(jié)滑膜及關(guān)節(jié)液中，多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)顯著增高，如TNF-α、IL-1和IL-6等，這些炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá)可導(dǎo)致滑膜炎性反應(yīng)和骨質(zhì)破壞。盡管導(dǎo)致這些炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加的機(jī)制目前尚未完全清楚，但核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1在炎性細(xì)胞因子表達(dá)中的作用已受到學(xué)者廣泛的關(guān)注。

NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，有文獻(xiàn)報(bào)道在RA滑膜組織中NF-κB異常高表達(dá)，而且滑膜細(xì)胞遭受炎性因子刺激時(shí)NF-κB被活化［1］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，CIA 小鼠滑膜中 NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加，NF-κB蛋白陽性細(xì)胞主要位于滑膜襯里細(xì)胞層，并且胞核染色明顯強(qiáng)于胞質(zhì)染色，同時(shí)CIA小鼠滑膜中NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯增強(qiáng)。提示在RA滑膜中，NF-κB在某些因素刺激下表達(dá)和活性增強(qiáng)，進(jìn)而使炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)，導(dǎo)致滑膜炎性反應(yīng)和骨質(zhì)破壞。

AP-1是炎性細(xì)胞因子刺激所活化的另一重要核轉(zhuǎn)錄因子［2］。為了探討AP-1在RA病變中的作用，本研究采用免疫組織化學(xué)法和EMSA法對(duì)CIA小鼠滑膜中AP-1的表達(dá)和活化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜中AP-1蛋白表達(dá)增加，并且AP-1 DNA結(jié)合活性增強(qiáng)。AP-1的表達(dá)增加和活性增強(qiáng)可能與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路活化有關(guān)?；罨腗APK(包括P38、ERK、JNK等)可使 AP-1磷酸化而活性增強(qiáng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

［1］Muller-Ladner U，Gay RE，Gay S．Role of nuclear factor kappaB in synovial inflammation［J］．Curr Rheumatol Rep，2002，4:201－207．

［2］ Peng SL．Transcription factors in autoimmune diseases［J］．Front Biosci，2008，13:4218 －4240．

［3］Luo X，Zuo X，Mo X，et al．Treatment with recombinant Hsp72 suppresses collagen-induced arthritis in mice［J］．Inflammation，2011，34:432 －439．