陳章榮，吳新華*，羅開良，何 泉，向玉鸞

(1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南大理6710000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶410010;3.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶410016)

心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細(xì)胞肥大是心肌梗死后心肌重塑的重要特征之一，參與心衰的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，防治病理性心肌細(xì)胞肥大對(duì)防治心肌重塑及心衰的發(fā)生發(fā)展有重要意義。近年來(lái)的研究表明，蛋白酶體系統(tǒng)的活性增加與心肌肥厚有明顯關(guān)系，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑能改善壓力負(fù)荷過(guò)重的心肌肥厚［1－2］。研究表明蛋白酶體抑制劑PS-519通過(guò)抑制NF-κB的活性，抑制炎性因子表達(dá)而減輕小鼠心肌肥厚［3］。用MG-132可以使肥大心肌細(xì)胞的體積縮小［4］。另外的研究表明蛋白酶體抑制劑MG-132通過(guò)抑制NF-κB活性，減輕炎癥因子表達(dá)而減輕減輕大鼠心肌缺血再灌注的損傷［5］。因此，推測(cè)MG-132可以通過(guò)抑制NF-κB活性改善心肌梗死后心肌肥厚，本研究對(duì)此進(jìn)行探討。

1 方法

1.1 動(dòng)物心肌梗死模型的建立及給藥方法

健康清潔級(jí)體質(zhì)量相近的SD大鼠，雌雄各半，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(合格證號(hào):SCXK［渝］2007-0001)，體質(zhì)量250±50 g。心肌梗死模型制作參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。胸骨左緣第2～4肋開胸，以左冠脈主干為標(biāo)志，在左心耳下方2 mm處進(jìn)針，6/0號(hào)絲線結(jié)扎左前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域變白，心電圖多于兩個(gè)肢導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬至少0.2 mV，則判斷為造模成功。將造模成功且術(shù)后24 h仍存活的大鼠隨機(jī)分為MI組和MG組。另設(shè)假手術(shù)(SH)組，SH組在相同冠脈部位只穿線不結(jié)扎。每組動(dòng)物均為6只。MG組于術(shù)后24 h腹腔內(nèi)注射MG-132(Calbiochem公司)0.1 mg/(kg·d)［7］，連續(xù)給藥28 d，MI 組及SH組給0.9%氯化鈉注射液對(duì)照。

1.2 超聲心動(dòng)圖、左室質(zhì)量指數(shù)及標(biāo)本采集

大鼠在處死前均行超聲心動(dòng)圖(HP/SONOS 5500多普勒超聲儀，探頭頻率4～10 MHz)，測(cè)定左室后壁厚度。處死動(dòng)物，摘取心臟，剔除血管組織及右心室，稱取左心室濕重，除以體質(zhì)量獲得左室質(zhì)量指數(shù)(mg/g)。然后沿左心室長(zhǎng)軸分為3份，心底部及心尖部置于液氮速凍后置－70℃保存用于反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)。中間部分切成3 mm的薄片，4%多甲醛溶液固定24 h后，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。

1.3 非梗死區(qū)心肌細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)及平均直徑

每個(gè)標(biāo)本選2張?zhí)炖切杉t染色切片，用北航CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量天狼猩紅染色切片中心心肌細(xì)胞各種形態(tài)參數(shù)。每張切片選擇5個(gè)視野，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算出各視野中心肌細(xì)胞形態(tài)參數(shù)值:心肌細(xì)胞面積、周長(zhǎng)及平均直徑。

1.4 半定量RT-PCR檢測(cè)NF-κB及IL-1β表達(dá)

隨機(jī)取各組大鼠心肌組織，按Trizol法提取心肌組織總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)RNA的完整性后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。取2 μg總RNA，以AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Toyobo公司，日本)合成cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:Oligo 5 μL，總 RNA 7 μL，L.5 ×RT 緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNAase 抑制劑1 μL，ReverTraAce 1 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:30 ℃10 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min。引物由上海博尚生物公司合成，NF-κB P65:上游5'-CAGCACATC CAGACAGACACCA-3'，下游 5'-GCTGCTAAAAGAA TCCTCAAAACC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度480 bp;IL-1β:上游 5'-CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3'，下游 5'-AAGAC AAACCGCTTTTCCATC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度381 bp;β-actin:上游 5'-CAGCTTCTTCTAGTGCCGTTCC-3'，下游 5'-GGAGTCAGGTGTTTCTGGTGGAG-3'， 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度219 bp。反應(yīng)體系:滅菌蒸餾水35 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，上 游 引 物 1.5 μL，下 游 引 物 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，Taq 酶1 μL，cDNA 2 μL。NF-κB P65的PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min;IL-1β及β-actin的退火溫度分別為50℃、58℃，其余反應(yīng)條件與NF-κB P65反應(yīng)條件相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)含Goldview的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照、掃描。QuantityOne4.6軟件進(jìn)行圖像分析計(jì)算 NF-κB P65及IL-1β產(chǎn)物相對(duì)量。吸光面積積分比值表示DNA含量，以NF-κB P65及IL-1β與β-actin擴(kuò)增條帶的吸光面積積分比值評(píng)定mRNA表達(dá)水平。

1.5 免疫組化檢測(cè)NF-κB、IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)

用免疫組織化學(xué)SP法(SP試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗大鼠 NF-κB P65 IgG、兔抗大鼠IL-1β IgG為Santa Cruz)觀察心肌細(xì)胞NF-κB P65和IL-1β蛋白表達(dá)情況。石蠟包埋切片脫蠟，梯度乙醇浸泡，PBS沖洗，5%山羊血清封閉后，兔抗大鼠NF-κB P65 IgG和兔抗大鼠IL-1β(抗體濃度1∶100)孵育4℃過(guò)夜。次日分別滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，拍照。高倍鏡下觀察核因子P65蛋白表達(dá)情況，半定量分析方法參照文獻(xiàn)［8］所述，以心肌細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性指數(shù)(PI)，PI=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù))×100%。每片觀察5個(gè)非重疊高倍視野，取平均值。IL-1β以心肌細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每片隨機(jī)觀察5個(gè)非重疊高倍視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image proplus 5.1，Media Cybernetics，USA)計(jì)算積分吸光度值(IA)作為半定量參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料采用SPSS12.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 左室后壁厚度、左室質(zhì)量指數(shù)

與SH組比較，MI組和MG組左室后壁厚度、左室質(zhì)量指數(shù)增加(P＜0.01)，而MG組大鼠的上述指標(biāo)均得到明顯改善(P＜0.01)(表1)。

表1 各組的左室后壁厚度、左室質(zhì)量指數(shù)Table 1 The values of left ventricle posterior wall thickness and left weight index in all groups(x ± s，n=6)

2.2 非梗死區(qū)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)

與SH組比較，MI組和MG組心肌細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)、平均直徑顯著增加 (P＜0.01)，而MG組大鼠的上述指標(biāo)均得到明顯改善 (P＜0.01)(圖1，表2)。

2.3 NF-κB和IL-1β的mRNA表達(dá)

與SH 組相比，MI組和 MG 組 NF-κB、IL-1β 的mRNA表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)，與MI組相比，MG組的mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)(圖2，表3)。

圖1 各組的細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)及直徑Fig 1 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(×200)

表2 各組的細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)、直徑Table 2 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(x ± s，n=6)

圖2 大鼠心肌NF-κB、IL-1β的RT-PCR結(jié)果Fig 2 The mRNA levels of NF-kappaB P65 and IL-1β in all groups

表3 NF-κB、IL-1β的 mRNA 表達(dá)量Table 3 The mRNA levels of NF-kappaB P65 and IL-1β in all groups(x ± s，n=6)

2.4 NF-κB、IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)

結(jié)果見，MI組和MG組NF-κB、IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)于SH組明顯增加(P＜0.01)，MG組與MI組相比，其蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)(圖3，表 4)。

3 討論

圖3 免疫組化法檢測(cè)NF-κB和IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)Fig 3 The myocardial cell surface area，perimeter and direct in all groups(×200)

表4 NF-κB、IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)量Table 4 The protein levels of NF-kappaB P65 and IL-1βin all groups(x ± s，n=6)

泛素－蛋白酶體系統(tǒng)在心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育中扮演重要角色［9］，其功能失調(diào)與心肌缺血、肥厚、纖維化以及心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［10］。心肌肥厚模型中心內(nèi)膜下心肌的蛋白酶體亞基表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑改善心肌肥厚成為可能［1］。體外實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用MG-132可以使肥大心肌細(xì)胞的體積縮?。?］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，MG-132可改善壓力負(fù)荷過(guò)重導(dǎo)致的心肌肥厚［2］。然而，尚未見MG-132改善心肌梗死后心肌肥厚的研究報(bào)道，鑒于此，本研究進(jìn)行探討。

本研究制作大鼠心肌梗死模型，測(cè)量左室后壁厚度及計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)，計(jì)算非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)如心肌細(xì)胞的直徑、周長(zhǎng)和表面積。結(jié)果顯示MI組的上述指標(biāo)較sham組增加，說(shuō)明心肌梗死后發(fā)生了非梗死區(qū)肥厚。而MG組的上述指標(biāo)較MI組明顯降低，說(shuō)明MG-132干預(yù)能改善梗死后非梗死區(qū)的心肌肥厚。心肌梗死后心肌處于缺血狀態(tài)，出現(xiàn)大量損傷蛋白，泛素蛋白酶體活性代償性增加。當(dāng)泛素蛋白酶體的活性過(guò)高時(shí)，一方面促進(jìn)心肌肥厚抑制物如環(huán)磷酸腺苷受體降解，導(dǎo)致心肌肥厚［9］;另一方面，泛素蛋白酶體活性過(guò)高促進(jìn)NF-κB激活，NF-κB 激活與心肌肥厚有密切關(guān)系［11］。蛋白酶體抑制劑通過(guò)抑制蛋白酶體活性，能減輕心肌肥厚［1］。本研究的結(jié)果表明，小劑量MG-132可以改善心肌梗死大鼠非梗死區(qū)的心肌肥厚。

本研究在基因和蛋白質(zhì)水平對(duì)NF-κB、IL-1β在心肌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示MI組的NF-κB蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)增加，證明NF-κB在心肌梗死后存在持續(xù)激活，最近的研究也證明了心肌梗死后存在 NF-κB 的激活［12］。激活的 NF-κB 通過(guò)增加炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，這些因子通過(guò)一系列的信號(hào)通路參與心肌細(xì)胞肥大過(guò)程。本研究中，MI組的IL-1β在基因和蛋白質(zhì)水平呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明了心肌梗死后心肌肥厚過(guò)程中存在炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加，這與文獻(xiàn)［13］報(bào)道相符。IL-1β可通過(guò)活化C-JUN氨基端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶以及促分裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路導(dǎo)致心肌肥厚［14］，使用 MG-132后 NF-κB 及其下游的炎性細(xì)胞因子(如IL-1β)降低，IL-1β的表達(dá)與NF-κB成一致變化，證實(shí)MG-132通過(guò)抑制NF-κB激活，降低炎性細(xì)胞因子如IL-1β的表達(dá)水平使非梗死區(qū)心肌肥厚得到改善。

雖然本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MG-132能改善大鼠心肌梗死后心肌肥厚，為心肌梗死的治療提供了一種新的思路和方法。然而，由于心肌肥厚的機(jī)制較為復(fù)雜，MG-132是否通過(guò)其他機(jī)制改善心肌肥厚以及其抑制NF-κB激活的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

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