吳 剛，張曉健，白 光

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，遼寧錦州121000)

胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(pancreatic ductal epithelial cells，PDECs)可在適宜的條件下增殖分化為胰島素分泌細(xì)胞，是胰島移植治療糖尿病(diabetes mellitus，DM)的理想種子細(xì)胞。但是，目前還沒有一套良好的PDECs培養(yǎng)增殖的實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)現(xiàn)PDECs體外大量增殖成為亟待解決的問題。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一種能特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子［1－5］，對(duì)多種器官具有保護(hù)作用，并且在損傷修復(fù)過程中大量表達(dá)，可通過促進(jìn)有絲分裂、激活信號(hào)通路及調(diào)節(jié)酶活性等方面促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和遷移作用。本實(shí)驗(yàn)以大鼠胰腺組織為材料，建立一種良好有效的PDECs培養(yǎng)增殖方法，并探討不同濃度的KGF在體外對(duì)大鼠PDECs增殖的影響，尋找解決胰島供體短缺的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠20只，6～7周齡，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［SYXK(遼)2009-0004］。

1.2 主要試劑

KGF、DTZ、V型膠原酶和 CK19單克隆抗體(Sigma公司);Hank's液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基(1∶1)和FBS(Gibco公司);DMSO、DAB酶底物顯色試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.3 原代PDECs的分離、純化和培養(yǎng)

所有大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。采用逆行膽管灌注膠原酶法獲得細(xì)胞。采用不連續(xù)密度梯度離心法、差速貼壁法純化細(xì)胞。將部分細(xì)胞懸液移入非黏附培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基(50 μg/L霍亂毒素、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 g/L ITS);另將部分細(xì)胞培養(yǎng)于放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，行細(xì)胞鑒定。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物

收集6孔板中的蓋玻片(蓋玻片上接種有第4代細(xì)胞，正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，PBS(pH=7.4)沖洗，4%多聚甲醛固定，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的滲透化處理(0.1%tritonx-100)室溫10 min，50 μL正常動(dòng)物非免疫血清封閉，一抗為50 μL的小鼠抗大鼠CK19單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜。二抗為50 μL羊抗小鼠抗體(1∶50)，37℃孵育30 min。蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封固。

1.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志

提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)Nestin、CK19、Insulin和Glucagon的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)序列(表1)。

1.6 PDECs向胰島素分泌細(xì)胞的分化

將第2～3代細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有低糖培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4～6 d。取誘導(dǎo)分化物3 mL，加入

表1 引物設(shè)計(jì)序列Table 1 Sequence of primer

配制好的終濃度為140 mg/L的DTZ溶液5 μL，輕輕振蕩混勻，室溫下靜止6～10 min，倒置顯微鏡下觀察。分別消化誘導(dǎo)分化前后的細(xì)胞，1×105個(gè)/mL濃度接種于24孔板。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸凈培養(yǎng)液，加入1 mL含2.8 mmol/L糖的D-Hank's液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，收集上清液凍存待測(cè)基礎(chǔ)胰島素水平;而后加入含16.7 mmol/L糖的D-Hank's液培養(yǎng)1 h，收集上清液采用放射免疫法(RIA法)測(cè)定分化前后兩種細(xì)胞不同糖濃度刺激下胰島素釋放含量。

1.7 不同濃度的KGF對(duì)PDECs增殖的影響

消化80% ～90%匯合生長(zhǎng)的PDECs，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/L，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，共3個(gè)板，5%CO237℃下培養(yǎng)。分為5組，1～4組加入KGF，使其終濃度分別為5、10、15和20 μg/L;第5組加入等量的 DMEM/F12 作為陰性對(duì)照組。每組4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)一空白對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)，比色時(shí)用于調(diào)零。繪制KGF促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較采用t檢驗(yàn)，組間采用方差分析進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 原代PDECs的分離、純化和培養(yǎng)

圖1 分離培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞Fig 1 PDECs morphology(×100)

膠原酶灌注胰腺后充盈良好，胰腺各部分膨脹均勻。倒置顯微鏡下觀察可見原代細(xì)胞中大量圓形細(xì)胞懸浮，細(xì)胞形態(tài)不一，呈梭形、三角形、楔形等(圖1A)。48 h后胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞開始貼壁，呈多型性，并逐漸分裂生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，細(xì)胞逐漸融合為“鵝卵石樣”結(jié)構(gòu)排列，細(xì)胞形態(tài)趨向一致(圖1B)。通過差速貼壁法及改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d內(nèi)，細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，從第5天開始增殖加速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞逐漸呈多角形，形態(tài)單一，并逐漸匯合成片。培養(yǎng)第10天開始呈上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，11～13 d左右細(xì)胞達(dá)80%貼壁(圖1C)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物

蓋玻片上的單層上皮細(xì)胞胞質(zhì)染色呈棕色，CK19染色陽(yáng)性率達(dá)到(92.4±2.8)%(圖2)。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞表達(dá)CK19Fig 2 Expression of CK19 of PDECs by immunocytochemical stain(×100)

2.3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物

PDECs的 Nestin和 CK19表達(dá)陽(yáng)性，而 Insulin及Glucagon表達(dá)陰性(圖3)。

2.4 PDECs向胰島素分泌細(xì)胞的分化

圖3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig 3 Expression of cell surface marker by RT-PCR

PDECs經(jīng)低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后，上皮樣細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量圓形細(xì)胞，并逐漸聚集成細(xì)胞團(tuán)，懸浮于培養(yǎng)液中。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)圓形或橢圓形，稱為類胰島樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)DTZ染色后細(xì)胞團(tuán)呈紅色或猩紅色(圖4)。

圖4 胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞經(jīng)低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化為類胰島樣結(jié)構(gòu)Fig 4 PDECs were induced to differentiate into islet-like cells(×100)

10、20和30mmol/L糖濃度下，分化后細(xì)胞胰島素釋放量顯著高于分化前(P＜0.01)(表2)。

表2 分化前后細(xì)胞對(duì)不同濃度糖溶液的胰島素反應(yīng)能力Table 2 Reaction of PDECs to insulin of different glucose concentrations before and after differention(x ± s，n=8)

2.5 不同濃度的KGF對(duì)PDECs增殖的影響

培養(yǎng)基中加入KGF后，MTT法測(cè)定不同濃度KGF對(duì)PDECs增殖的影響(表3)。

培養(yǎng)2 d時(shí)，20 μg/L組細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組;6～10 d時(shí)，10、15 和20 μg/L組細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);第12天，20 μg/L組細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。倒置顯微鏡下觀察20 μg/L組PDECs均存活，形態(tài)正常，細(xì)胞密度大，增殖活躍。

3 討論

目前尚無(wú)特異的 PDECs標(biāo)志物。CK19是PDECs生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要因子，被認(rèn)為是PDECs向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一［6－8］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)第2代導(dǎo)管上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK19染色陽(yáng)性率在90%左右，說明分離的細(xì)胞可以表達(dá)胰腺干細(xì)胞的表面標(biāo)志，而且RT-PCR結(jié)果也顯示CK19 mRNA表達(dá)陽(yáng)性。Nestin是否是PDECs的表面標(biāo)志物還需進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)僅在基因水平檢測(cè)到第2代細(xì)胞有Nestin表達(dá)。

胰腺細(xì)胞包括內(nèi)分泌、外分泌及導(dǎo)管上皮細(xì)胞;其中腺泡細(xì)胞占82%，胰島細(xì)胞僅占1%。為了排除胰島細(xì)胞的污染，本研究應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Insulin和Glucagon的表達(dá)，結(jié)果顯示分離出的細(xì)胞為較純的PDECs，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來(lái)源。

為了檢測(cè)分化出的細(xì)胞能否分泌胰島素，本研究設(shè)計(jì)了不同糖濃度的培養(yǎng)基，用放免法測(cè)定分化前后胰島素分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化前的PDECs基本無(wú)分泌胰島素的能力，分化后的類胰島樣細(xì)胞團(tuán)對(duì)不同糖濃度均有反應(yīng)能力。從表3可以看出，0～20 μg/L的范圍內(nèi)，在同一時(shí)間下，隨著KGF濃度的增大，A值逐漸增加，且各組間有差異，說明KGF的增殖作用在本實(shí)驗(yàn)所選擇的劑量范圍內(nèi)呈濃度依賴性，各濃度組刺激2 d后細(xì)胞的增殖最為旺盛。

KGF是一個(gè)特異性的促上皮細(xì)胞增殖的高效生長(zhǎng)因子，對(duì)多種器官具有保護(hù)作用，在損傷修復(fù)過程中大量表達(dá)，可通過促進(jìn)有絲分裂、激活信號(hào)通路及調(diào)節(jié)酶活性等方面促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和遷移作用［9－10］。利用不同濃度的KGF刺激大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示:培養(yǎng)0～2 d細(xì)胞處于潛伏增殖期，細(xì)胞增殖活性在各組變化較小;第6天細(xì)胞增殖加速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～10 d細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)高峰，KGF各濃度組細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組。第12天細(xì)胞增殖到達(dá)平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸趨向停滯，但20 μg/L組細(xì)胞數(shù)仍顯著高于對(duì)照組，而其他各組細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)差異。所以在本實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，20 μg/L為促進(jìn)增殖的最佳濃度，該結(jié)果或許可為相似研究工作提供參考。

表3 MTT法測(cè)定不同濃度KGF對(duì)PDECs增殖的影響Table 3 Effects of KGF on cell proliferation shown by MTT(x ± s，n=5)

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