張春玉，宋 凱，高立宏，，郭立泉，李望豐，劉立俠

（1.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長春 130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024；3.長春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032）

土壤鹽漬化是威脅農(nóng)作物生產(chǎn)的非生物脅迫因素之一［1］.在鹽脅迫條件下，高等植物主要是通過Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)Na＋外排，抗拒鹽離子毒害［2－4］.隨著人們相繼在多種植物及酵母的生物膜上觀察到Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性［5－6］，有關(guān)質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的研究受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注.高等植物的一些鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制與酵母細(xì)胞具有相似性，因此，利用酵母系統(tǒng)來分離鑒定功能保守的高等植物基因被認(rèn)為是一條行之有效的快捷途徑［7－9］.

近年來，關(guān)于植物中Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白的研究已有很多報道，但是關(guān)于鹽地植物豬毛菜（Salsola collina Pall）Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的研究報道卻很少.本研究首次成功地從鹽生植物——豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHX1，并對其耐鹽能力進(jìn)行了驗證，這對挖掘鹽地植物優(yōu)質(zhì)耐鹽基因資源具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

豬毛菜采自于吉林省西部鹽堿地區(qū).酵母表達(dá)載體pPIC9和菌株GS115購于Invitrogen公司；克隆載體pMD18－T購于大連寶生物公司TaKaRa公司；DNA限制性內(nèi)切酶，Taq酶，T4DNA連接酶，RNA PCR kit，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA Marker購自大連寶生物公司.PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成.

1.2 實驗方法

1.2.1 SsNHX1基因編碼區(qū)克隆

根據(jù)SsNHX1基因全序列設(shè)計引物I（含Bam HI酶切位點）和J（含Eco RI酶切位點），序列如下：

提取豬毛菜葉片RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了SsNHX1基因的編碼區(qū)序列，將之連接在pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行鑒定及測序.將含有BamHI和EcoRI酶切位點的pMD18－T命名為pMD18－T1.

1.2.2 酵母重組表達(dá)載體pPIC－SsNHX1的構(gòu)建

將含有目的基因的pMD18－T1載體和表達(dá)載體pPIC9用Bam HI和Eco RI分別進(jìn)行雙酶切；試劑盒回收目的片段和載體片段，連接2h；取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，氨芐青霉平板篩選轉(zhuǎn)化子；用Bam HI和Eco RI酶切驗證重組質(zhì)粒，命名為pPIC－SsNHX1.

1.2.3 重組酵母轉(zhuǎn)化子的獲得

（1）重組載體的線性化和酵母的轉(zhuǎn)化

酶切表達(dá)載體pPIC－SsNHX1，凝膠回收目的片段；取20μL目的片段，加入100μL酵母感受態(tài)細(xì)胞，將二者混勻后，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)環(huán)，冰上放置10min，放入基因?qū)雰x中（寧波，新芝JY－2000－1B），調(diào)節(jié)其電壓為1500V，電容為50μF，電阻為200Ω.電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞7.2ms，立即加入700μL預(yù)冷的1mol／L山梨醇，混勻，混合物吸出至離心管中，30℃緩慢搖動1h；分別取100，200μL涂MD平板，充分吸干水分后，封口于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，2～3d后觀察轉(zhuǎn)化子生長情況.同時，取未轉(zhuǎn)化的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂MD平板作負(fù)對照.

（2）重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型鑒定

取培養(yǎng)在MM和MD培養(yǎng)基中（2～3d）的酵母轉(zhuǎn)化子（直徑3nm）觀察表型大?。?－10］.

（3）重組酵母轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)鑒定

酵母重組子液體MD中30℃過夜培養(yǎng)，提取酵母基因組DNA，以引物1做PCR檢測.

（4）重組酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽實驗

將重組酵母轉(zhuǎn)化子和空白酵母共同轉(zhuǎn)到含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板上，30℃培養(yǎng)2～3d.計算菌落的直徑和生長速率.

2 結(jié)果和分析

2.1 酵母表達(dá)載體pPIC－SsNHX1的構(gòu)建

我們從豬毛菜基因組中克隆了1700bp的SsNHX1基因編碼區(qū)全序列（兩側(cè)有Eco RI和Bam HI酶切位點），如圖1－A所示.將其連接到pMD18－T載體后進(jìn)行測序，連接結(jié)果見圖1－B.用Bam HI和Eco RI將SsNHX1基因卸載下來，回收后連接到酵母表達(dá)載體pPIC9的Bam HI和Eco RI位點中，同時將酵母表達(dá)載體pPIC9的信號肽替換掉，結(jié)果見1－C.酵母表達(dá)載體pPIC－SsNHX1示意圖見圖1－D.

圖1 酵母表達(dá)載體pPIC－SsNHX1構(gòu)建

2.2 重組酵母轉(zhuǎn)化子pPIC9－SsNHX1的獲得

用BglⅡ酶切重組的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9－SsNHX1，使其切線性化，利用電轉(zhuǎn)法將目的基因轉(zhuǎn)入到酵母基因組中獲得轉(zhuǎn)化子.由于轉(zhuǎn)化子中有組氨酸基因，而野生型的畢赤酵母GS115為組氨酸基因缺陷型，所以轉(zhuǎn)化子在不含組氨酸的選擇培養(yǎng)基MD上能正常生長.3d后挑取8個酵母單克隆菌落，分別挑至MM和MD培養(yǎng)基進(jìn)行對比培養(yǎng)，鑒定表型.如果二者酵母菌生長相似、菌落大小差不多，說明目的片段為單點插入整合，表型為His＋Mut＋；如果在MD培養(yǎng)基上生長的菌落明顯比MM培養(yǎng)基上的大，說明基因片段為雙點替換整合，表型為His＋Muts.我們挑取的8個酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過MM和MD培養(yǎng)基對比培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，從表型上看絕大部分是His＋Mut＋型，只有第4個菌落為His＋Muts型，結(jié)果如圖2所示.

圖2 豬毛菜SsNHX1酵母轉(zhuǎn)化子在MD和MM培養(yǎng)基上的生長表型鑒定

2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)鑒定

參照畢赤酵母表達(dá)手冊方法提取上述7個His＋Mut＋型酵母轉(zhuǎn)化子的總DNA，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測，方法和擴(kuò)增程序如前所述，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，7份酵母轉(zhuǎn)化子均為陽性，此結(jié)果表明外源目的基因已經(jīng)成功整合到酵母GS115基因組中.

圖3 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果

圖4 酵母轉(zhuǎn)化子在鹽脅迫條件下的生長情況

2.4 重組酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽實驗

為了驗證豬毛菜SsNHX1基因在酵母中是否能發(fā)揮耐鹽功能，30℃條件下，將4個轉(zhuǎn)化子和空白對照酵母培養(yǎng)在含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板中，培養(yǎng)2～3d后觀察，結(jié)果如圖4所示.從圖4我們可以看出，重組酵母轉(zhuǎn)化子的生長速率和菌落直徑均明顯高于對照，這初步表明豬毛菜SsNHX1基因能夠有效地提高酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力.

3 結(jié)論

本研究首次從鹽生植物豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHX1（EU073422），并以酵母為表達(dá)載體，獲得了陽性轉(zhuǎn)化子.耐鹽實驗表明整合有豬毛菜SsNHX1基因的酵母在含有0.5mol／L NaCl的培養(yǎng)基中，與對照相比有更高的生長速率.這與濱藜液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（AgNHX1）、棉花液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（GhNHX1）和小麥液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（TaNHX1）在酵母中表達(dá)的研究結(jié)果相似［7，9，11］.這充分證明了豬毛菜液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因在真核生物酵母的耐鹽脅迫中起到了重要的作用.

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