曲婉秋，唐曉琳，王秀武

遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029

殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠降血糖作用的研究

曲婉秋，唐曉琳，王秀武*

遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029

探討殼寡糖螯合鉻(Cos-Cr)的降血糖作用。選擇發(fā)育相近的健康雄性小鼠10只為正常對照組，糖尿病小鼠30只隨機(jī)分為糖尿病對照組、殼寡糖組(Cos)和螯合鉻組(Cos-Cr)，每組各10只，實驗期4 w，測定小鼠血糖值。殼寡糖螯合鉻可以降低糖尿病小鼠血糖，增加體重，增加脾臟指數(shù)，明顯緩解糖尿病小鼠饑餓和煩渴的癥狀。肝臟損傷明顯減輕。同時觀察肝組織病理變化。殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠有降糖，改善糖尿病癥狀的作用。

殼寡糖螯合鉻;四氧嘧啶;糖尿病;血糖;肝臟;脾臟

鉻(chromium)是人和動物體中脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物正常代謝所必須的微量元素之一［1］。補(bǔ)鉻對治療包括I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和類固醇引起的糖尿病都有效［2-7］。美國醫(yī)學(xué)家Mertz和Schwarz早在1957年就發(fā)現(xiàn)并證實Gr3+是葡萄糖耐受因子(GTF)中的活性因子。無機(jī)鉻的吸收率很低為0.4%～3%［8］，而有機(jī)鉻的吸收率可達(dá)10% ～25%［9］。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，大量研究發(fā)現(xiàn)它具有免疫調(diào)節(jié)［10］、抗腫瘤［11］及降血糖［12］等功能。目前，國內(nèi)外對殼寡糖用于糖尿病治療［13-18］的相關(guān)研究不斷增多。有研究對分子量為1200 Da的殼寡糖及其鉻配合物［19］進(jìn)行了研究，本實驗首次以分子量為1000 Da的六碳?xì)す烟呛蜔o機(jī)鉻(CrCl3)為原料螯合制備成易于吸收的有機(jī)鉻形式，目的在于產(chǎn)生協(xié)同作用，提高降糖活性，并進(jìn)一步探討了其對糖尿病小鼠的降糖作用。殼寡糖螯合鉻可用于開發(fā)新型的保健食品、醫(yī)藥，具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 殼寡糖螯合鉻

選擇平均分子量為1000 Da，脫乙酰度＞90%的殼寡糖(大連化物所1805室)和三氯化鉻為原料，按本研究室的方法制備成殼寡糖螯合鉻。

1.1.2 試驗動物

昆明種小鼠，雄性，體重為20±2 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.3 試劑和儀器

四氧嘧啶、苦味酸，購自Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;血糖儀，德國羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 殼寡糖螯合鉻的制備

稱取殼寡糖和氯化鉻用蒸餾水溶解配制成殼寡糖3%溶液，氯化鉻1%溶液，靜止20 min，將兩種液體等體積混合，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為9，靜止20 min，加入3倍體積的無水乙醇，經(jīng)40 min的螯合后，抽濾，并用蒸餾水沖洗沉淀物1-5次，除去殘留的濾液，將沉淀物置于70℃的烘箱中5～6 h除去水分后得到墨綠色粉末狀固體即為殼寡糖螯合鉻。

1.2.2 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型建立

選擇體重相近(20±2 g)，昆明種雄性小鼠75只，自由采食基礎(chǔ)日糧1 w，隨機(jī)選取10只為正常對照組，其余小鼠禁食16 h后，用生理鹽水配制1%四氧嘧啶按100 mg/kg·bw進(jìn)行腹腔注射，正常對照組注射等劑量的生理鹽水，1 h后恢復(fù)正常采食和飲水。次日，用同樣方法二次建模。3 d后斷尾取血，測量血糖值，血糖值在13.8 mmol/L以上，認(rèn)為是造模成功。

1.2.3 實驗設(shè)計及實驗過程

將合格實驗動物分為正常對照組、糖尿病對照組、殼寡糖組和螯合鉻組，每組各10只，共計40只。實驗期4 w。正常對照組和糖尿病對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，殼寡糖組和螯合鉻組是在基礎(chǔ)日糧中分別添加殼寡糖和殼寡糖螯合鉻0.7 g/kg。每日上午9時測定各組小鼠的攝食量和飲水量，每周測定一次小鼠的體重，同時尾部采血，測量血糖值。

實驗4 w結(jié)束時，將各組小鼠脫臼處死，立即分離肝臟和脾臟，并用生理鹽水清洗，擦干后脾臟稱重并計算脾指數(shù)，肝臟拍照，用Bouin液固定肝臟進(jìn)行H.E.染色，作病理組織學(xué)光鏡檢查。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠體重的影響

實驗開始時，各組小鼠的體重差異不明顯。實驗期間，糖尿病組小鼠隨實驗時間的延長體重逐漸下降(P＜0.05)。殼寡糖組和螯合鉻組小鼠體重試驗期各周均比糖尿病組增加，而螯合鉻組的小鼠體重隨實驗時間的延長體重增加顯著(P＜0.05)。結(jié)果如表1所示。

表1 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠體重的影響(g，±s)Table 1 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on body weight of diabetic mice(g，±s)

表1 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠體重的影響(g，±s)Table 1 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on body weight of diabetic mice(g，±s)

注:n=10;與正常組比較，*P＜0.05;＊＊P＜0.01。與模型組比較，▲▲P＜0.01。下同。Note:n=10;Compare with normal control，*P＜0.05;＊＊P＜0.01.Compare with diabetes control，▲▲P＜0.01.The same below.

組別Group實驗前Before experiment試驗期間Period experiment 1 w 2 w 3 w 4 w正常組Normal control 27.21±3.39 32.03±2.73 34.32±2.52 36.11±0.98 37.19±3.07模型組 Diabetes control 27.63±1.09 27.55±2.17*26.80±2.60＊＊26.02±1.24＊＊25.72±1.09＊＊殼寡糖組COS 27.57±1.28 27.57±2.11*27.08±2.09＊＊28.80±2.72＊＊30.24±1.63＊＊▲▲螯合鉻組COS-Cr 27.77±2.31 27.65±3.22*28.12±4.41*30.17±4.27*33.58±4.08▲▲

2.2 殼寡糖螯合鉻對小鼠攝食量、飲水量的影響

實驗開始時，各組小鼠的攝食量、飲水量差異不明顯。實驗開始后糖尿病組小鼠攝食量、飲水量不斷增加，殼寡糖組和螯合鉻組隨實驗時間的延長小鼠采食量、飲水量逐漸下降，自實驗開始后第3 w螯合鉻組小鼠采食量顯著減少(P＜0.05)，飲水量也顯著較少(P＜0.05)，螯合鉻組比殼寡糖組的飲水量減少趨勢明顯。結(jié)果如表2～3所示。

表2 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠攝食量的影響(g/d，±s)Table 2 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of food intake of diabetic mice(g/d，±s))

表2 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠攝食量的影響(g/d，±s)Table 2 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of food intake of diabetic mice(g/d，±s))

注:與模型組比較，▲P＜0.05。下同。Note:Compare with diabetes control，▲P＜0.05.The same below.

組別Group實驗前Before experiment試驗期間Period experiment 1 w 2 w 3 w 4 w正常組Normal control 7.14±0.34 7.20±0.45 7.26±0.36 7.48±0.50 7.60±0.59模型組Diabetes control 7.02±0.42 9.03±0.35＊＊9.70±0.39＊＊9.84±0.55＊＊9.96±0.48＊＊殼寡糖組COS 7.19±0.68 9.49±0.97＊＊9.28±0.72＊＊8.94±0.56＊＊8.61±0.49＊＊▲螯合鉻組COS-Cr 7.14±0.47 9.49±1.20＊＊9.00±0.86＊＊8.48±0.73＊▲8.20±0.50▲▲

表3 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠飲水量的影響(mL/d，±s)Table 3 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of water intake of diabetic mice(mL/d，±s)

表3 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠飲水量的影響(mL/d，±s)Table 3 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of water intake of diabetic mice(mL/d，±s)

組別Group實驗前Before experiment試驗期間Period experiment 1w 2w 3w 4w正常組Normal control 6.43±0.36 6.90±0.20 6.93±0.45 6.95±0.33 7.10±0.47模型組 Diabetes control 6.53±0.31 22.27±0.63＊＊22.44±0.77＊＊22.67±0.62＊＊22.88±0.81＊＊殼寡糖組COS 6.45±0.34 22.28±1.10＊＊21.15±0.72＊＊20.02±0.78＊＊▲▲19.52±1.00＊＊▲▲螯合鉻組COS-Cr 6.37±0.23 22.23±1.50＊＊20.70±2.20＊＊19.35±2.40＊＊▲▲18.57±2.20＊＊▲▲

2.3 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠血糖的影響

實驗開始時，各組小鼠空腹血糖值差異不顯著。實驗期間，糖尿病組小鼠空腹血糖一直維持在較高水平，而殼寡糖組和螯合鉻組的小鼠血糖水平在不斷下降，其中實驗第2 w(P＜0.05)和第4 w(P＜ 0.01)下降顯著，而螯合鉻組下降極顯著。實驗4 w同1 w相比，殼寡糖組血糖平均值下降了1.99 mmoL/L，螯合鉻組血糖平均值下降了2.76 mmoL/ L。表明殼寡糖螯合鉻具有明顯降低糖尿病小鼠空腹血糖值的作用。結(jié)果如表4所示。

表4 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠血糖的影響(mmol/L·d，±s)Table 4 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of blood glucose of diabetic mice(mmol/L·d，±s)

表4 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠血糖的影響(mmol/L·d，±s)Table 4 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on the content of blood glucose of diabetic mice(mmol/L·d，±s)

組別Group實驗前Before experiment試驗期間Period experiment 1w 2w 3w 4w正常組normal control 6.61±0.23 6.67±0.93 6.60±0.35 6.89±0.91 6.86±0.30模型組diabetes control 6.93±1.69 17.21±1.17＊＊17.69±1.01＊＊18.31±1.33＊＊19.03±2.34＊＊殼寡糖組COS 6.79±0.74 17.58±1.49＊＊17.12±1.13＊＊16.81±0.52＊＊▲15.59±1.05＊＊▲螯合鉻組COS-Cr 6.47±0.85 17.50±1.02＊＊16.03±0.63＊＊▲15.21±0.19＊＊▲▲14.74±0.23＊＊▲▲

2.4 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠脾指數(shù)的影響

與正常對照組相比，殼寡糖組和螯合組的脾臟指數(shù)都下降了，說明脾臟明顯萎縮，特異性免疫功能顯著下降。與糖尿病組相比，殼寡糖組和螯合鉻組的脾臟指數(shù)都上升了，而螯合鉻組上升的更多，表明經(jīng)飼喂殼寡糖和殼寡糖螯合鉻的小鼠，脾指數(shù)明顯提高。結(jié)果如表5所示。

表5 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠脾指數(shù)的影響(±s)Table 5 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on spleen index of diabetic mice(±s)

表5 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠脾指數(shù)的影響(±s)Table 5 Effect of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex on spleen index of diabetic mice(±s)

組別Group脾臟質(zhì)量(mg) Spleen weight(mg)脾指數(shù)(g/mg) Spleen index(g/mg)正常組normal control 141.28±10.57 4.01±0.23模型組diabetes control 76.60±7.65 2.66±0.17＊＊殼寡糖組COS 120.70±12.77 3.53±0.45▲螯合鉻組COS-Cr 129.80±12.30 3.99±0.20▲▲

2.5 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠肝臟損傷的修復(fù)

取各組小鼠的肝臟進(jìn)行觀察，正常對照組小鼠肝臟(A)，表面平整光滑，肝葉清晰，顏色正常，質(zhì)地柔軟。糖尿病組小鼠肝臟(B)，葉片嚴(yán)重粘連，不清晰，肝臟萎縮，重量減輕，質(zhì)地變硬。殼寡糖組小鼠肝臟(C)與糖尿病組小鼠相比肝小葉粘連情況好轉(zhuǎn)，但是與殼寡糖螯合鉻組(D)相比，粘連情況嚴(yán)重些。殼寡糖螯合鉻組小鼠雖也有呈球狀樣變的趨勢，但與糖尿病組相比，肝小葉粘連狀況明顯好轉(zhuǎn)。結(jié)果如圖1所示。

圖1 殼寡糖螯合鉻對糖尿病小鼠肝臟損傷的修復(fù)Fig.1 hepatic tissue after alloxan treatment and with the COS and Cos-Cr

2.6 組織病理學(xué)檢查

正常組(A)肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常。模型組(B)中央靜脈周圍肝細(xì)胞皺縮變形，部分壞死，炎細(xì)胞侵潤。殼寡糖組(C)和螯合鉻組(D)也有一定的炎細(xì)胞侵潤和肝細(xì)胞變形，與模型組(B)相比炎細(xì)胞侵潤數(shù)量減少，肝細(xì)胞變形也減少。但螯合鉻組(D)要比殼寡糖組(C)修復(fù)效果更佳。

圖2 實驗各組小鼠肝臟組織切片結(jié)果Fig.2 The tissue pathologic sections of any groups of mice liver(400×)

3 討論

四氧嘧啶可以破壞胰島β細(xì)胞從而使動物患糖尿病［20］。本實驗中注射飼養(yǎng)嘧啶小鼠血糖值大于13.8 mmol/L，說明造模成功。肝臟是胰島素作用的主要靶器官，胰島素特異性受體大量存在于肝細(xì)胞膜上，糖尿病病理過程中由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量自由基損傷肝臟細(xì)胞膜，從而使肝細(xì)胞膜胰島素受體減少，敏感性降低，對血糖利用率下降［21］。本實驗發(fā)現(xiàn)四氧嘧啶也可造成小鼠肝臟損傷，推測是四氧嘧啶在體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致肝臟損傷。同時表明殼寡糖螯合鉻能夠有效的抑制四氧嘧啶引發(fā)小鼠肝臟自由基升高。殼寡糖降低血糖作用可能與其能作用于胰島素受體，使胰島素受體敏感性增強(qiáng)，從而控制血糖升高有關(guān)［22］。鉻作為糖尿病耐量因子(GTF)的主要成分參與體內(nèi)糖脂代謝，并可通過硫氫鍵使胰島素結(jié)合到膜受體上，從而增加胰島素效應(yīng)，并影響胰島素依賴系統(tǒng)，抑制胰島素酶［23］。本實驗表明殼寡糖螯合鉻能夠顯著降低糖尿病小鼠的血糖值，推測可能是殼寡糖和氯化鉻的協(xié)同作用增強(qiáng)了降糖效果，并能有效地改善糖尿病小鼠“三多一少”的癥狀，使體重增加，同時使增加脾指數(shù)，肝臟損傷明顯減輕，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Hypoglycemic Effects of Chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ) Complex on Diabetic Mice

QU Wan-qiu，TANG Xiao-lin，WANG Xiu-wu*
College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116029，China

To study the effects of chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ)complex(Cos-Cr)on diabetic mice.Selecting ten male mice as the normal control group.Thirty diabetes mice were randomly divided into 3 groups，diabetes control group (n=10)，Cos group(n=10)，Cos-Cr group(n=10).The mice were dissected after 4 weeks，determinations of serum glucose concentration.Cos-Cr can significantly decrease fasting blood glucose level，increase body weight as well as index spleen.Symptoms of hunger and thirsty were improved obviously in diabetic mice.Cos-Cr has protective effects on alloxan-induced hepatic injury in mice.Hepatocytes lesion was alleviated markedly.Cos-Cr can decrease blood glucose concentration and improve diabetic symptoms in mice.

chitooligosaccharide-chromium(Ⅲ);alloxan;diabetic;blood glucose;liver;spleen

R151.2

A

1001-6880(2012)05-0605-05

2011-10-12 接受日期:2011-12-23

*通訊作者 E-mail:quwanqiu@163.com