余桂芳，嚴躍紅，王瑞鑫，曾文鋌，朱科倫

(1廣州醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院內(nèi)一科，廣東廣州510700;2廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝病研究室，廣東廣州510120)

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，大部分肝癌患者就診時已失去手術(shù)機會，經(jīng)肝動脈化療栓塞成了主要的治療措施。然而化療栓塞后高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響了患者的預(yù)后。多項研究結(jié)果表明［1-3］，肝動脈化療栓塞后殘存腫瘤組織微血管密度增加，殘存癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，從而促進肝癌化療栓塞后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，探討缺氧對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其可能機制，為肝癌化療栓塞程度以及栓塞后抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移治療的選擇，減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，改善肝癌患者生活質(zhì)量，延長生命提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人肝癌HepG2細胞株由廣州醫(yī)學(xué)院微生物免疫教研室提供;24孔 Transwell小室(孔徑8 μm)購自Costar;Matrigel及層黏連蛋白購自BD;變異型白細胞分化抗原(CD44v6)兔抗人多克隆抗體來源于武漢博士德生物工程有限公司;即用型免疫組化Biotin-SP-HRP試劑盒購自北京鼎國公司;明膠蛋白購自Amersco;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自TaKaRa。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清，青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L)，將細胞置于CO2細胞培養(yǎng)箱獨立密閉小室，充入5%CO2和95%N2混合氣體，用測氧儀分別調(diào)整氧濃度為1%、3%、5%，分別培養(yǎng)24 h，以常氧培養(yǎng)為對照組。

2.2 MTT法測定人肝癌HepG2細胞對基底膜的黏附能力 不同氧濃度培養(yǎng)24 h后的HepG2細胞，用胰酶消化為單細胞懸液，臺盼藍染色后計數(shù)。將matrigel包被96孔板，2%BSA封閉。細胞懸液加入包被好的96孔板中，作用30 min、60 min、90 min和120 min后吸出培養(yǎng)液及未黏附細胞，每孔加入5 mg/L MTT 20 μL，用酶標儀于波長570nm處測定各孔吸光度值(A值)，以A值代表黏附細胞數(shù)，按下列公式計算細胞黏附率及黏附抑制率:黏附率=(黏附前細胞A值-黏附后細胞A值)/黏附前細胞A值×100%;黏附抑制率=(對照組細胞黏附率-處理組細胞黏附率)/對照組細胞黏附率×100%。

2.3 Transwell小室觀察人肝癌細胞侵襲及游走能力 將人工基底膜Matrigel按上法稀釋后，每室100 μL均勻鋪于小室腔膜上，成膠后于小室濾膜下面均勻涂上5 μg層黏連蛋白，放進24孔板中，紫外線照射2 h。實驗前以預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基37℃水化90 min后去除培養(yǎng)基，將上述單細胞懸液加入其中。不同條件下孵育箱培養(yǎng)24 h;取出各組Transwell小室，無水乙醇固定，HE染色，中性樹膠封片后光鏡下觀察(10×20)5個視野穿膜細胞數(shù)，計算平均每個視野細胞。游走實驗與侵襲實驗相似，僅在Transwell小室腔上不鋪Matrigel。

2.4 免疫細胞化學(xué)染色(biotin-SP-HRP染色法)檢測HepG2細胞CD44v6的表達 不同氧濃度處理的HepG2細胞，按常規(guī)方法免疫細胞化學(xué)染色，方法參照免疫組化試劑盒說明進行。CD44v6主要表達于細胞膜與細胞漿中，其陽性表達以細胞質(zhì)及質(zhì)膜出現(xiàn)明顯的黃棕色顆粒狀沉積為準。排除爬片邊沿細胞。10×10低倍鏡下隨機選取10個細胞分布均勻的視野，每視野10×20倍鏡下隨機計數(shù)50個細胞。按細胞著色強弱分為4個等級:無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3;Pi表示評分為 i的比例)計算爬片H-SCORE得分。該評分方法較具體、真實地從總體水平反映細胞內(nèi)蛋白表達的情況。陽性率=(1+2+3)細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.5 膠質(zhì)酶譜分析 上述處理后的細胞使用常規(guī)方法抽提細胞總蛋白，并進行蛋白定量。明膠酶譜分析按傳統(tǒng)方法:上樣含1 g/L明膠的10%SDSPAGE凝膠電泳，0.5%考馬斯亮藍染色，脫色。凝膠經(jīng)圖像分析軟件成像分析，讀取圖像反轉(zhuǎn)模式后各消化條帶的灰色度及其面積。

2.6 RT－PCR 上述處理后的細胞按常規(guī)方法用trizol試劑提取細胞總RNA，然后進行一步法反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。PCR引物序列如下。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α):上游引物5'-GCTCCCTATATCCCAATGGAT-3'，下游引物5'-CCATCATGTTCCATTTTTCGC-3'，產(chǎn)物長度 491 bp。血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF):上游引物 5'-ACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAG-3'，下游引物 5'-GCATTCACATTTGTTGTGCTGT-3'。β-actin:上游引物5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，下游引物5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，掃描圖像進行密度分析，分別以各目的基因電泳條帶總灰度值與β-actin電泳條帶總灰度值之比進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 缺氧對HepG2細胞黏附能力的影響

由表1可見，隨著HepG2細胞對Matrigel作用時間的延長，細胞黏附率增加。相同作用時間，經(jīng)低氧處理后HepG2細胞的黏附率也增高，其中3%氧處理后HepG2細胞的黏附率增高最為明顯，60 min達最高黏附抑制率-33.9%，與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與對照組比較，5%氧處理組的黏附能力也顯著增強(P＜0.05)，而1%氧處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 不同濃度氧處理HepG2細胞的黏附率變化Table 1.Adhesion rates of the HepG2 cells exposed to different concentrations of oxygen examined by MTT assay(%.±s.n=5)

表1 不同濃度氧處理HepG2細胞的黏附率變化Table 1.Adhesion rates of the HepG2 cells exposed to different concentrations of oxygen examined by MTT assay(%.±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.The inhibitory rates were given in parenthesis.

.66±2.88 1%O2 25.91±2.01(3.42)Group 30 min 60 min 90 min 120 min Control 26.83±2.31 46.58±2.34 67.53±2.78 82 82.83±2.31(-0.20)3%O2 36.46 ±2.10＊＊(-35.9)44.29±2.45(4.91)66.33±2.59(1.78)92.07 ±2.44＊＊(-11.4)5%O2 31.71±2.34*(-18.2)62.37 ±2.51＊＊(-33.9)85.69 ±2.52＊＊(-26.9)54.28 ±2.31＊＊(-16.5)76.43 ±2.46＊＊(-13.2)87.66±2.78*(-6.0)

2 缺氧對HepG2細胞穿透基底膜與遷移能力的影響

由圖1、2可見，低氧處理后，遷移和穿透基底膜的HepG2細胞數(shù)增多。與對照組比較，3%氧處理組和5%氧處理組穿透基底膜及遷移的細胞均顯著增加(P＜0.05，n=5)，而1%氧處理后無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

3 CD44v6表達變化

HepG2細胞中CD44v6陽性信號主要位于細胞膜與細胞漿內(nèi)，呈黃棕色顆粒沉積，見圖3，常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的HepG2細胞CD44v6陽性率為(91.70±0.55)%，H-SCORE得分為 2.85±0.06，見表 3。不同濃度氧處理后，僅3%和5%氧處理組表現(xiàn)為H-SCORE和陽性率增高(P＜0.01，n=5)，以3%氧處理組最為顯著。與對照組比較，1%氧處理組CD44v6陽性率和H-SCORE稍微下降，但無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Effects of different concentrations of oxygen on metastasis ability of HepG2 cells(HE staining，×100).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.圖1 不同濃度氧對HepG2細胞游走遷移的影響

Figure 2.Effects of different concentrations of oxygen on invasion ability of HepG2 cells(HE staining，×100).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.圖2 不同濃度氧對HepG2細胞穿透基底膜的影響

4 MMP－9與MMP－2的表達變化

如圖4所示，各組均可見2個主要條帶，根據(jù)分子量大小分別鑒定為MMP-9和MMP-2。根據(jù)灰度值分析，3%和5%氧處理組MMP-9和MMP-2的表達顯著增高(P＜0.05，n=5)，而1%氧處理組未見顯著差異(P＞0.05)。

Figure 3.Changes of the expression of CD44v6 in HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(immunostaining，×400).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.圖3 不同缺氧狀態(tài)下人肝癌細胞CD44v6表達的變化

表2 不同濃度氧處理后穿透基底膜與游走遷移的細胞數(shù)Table 2.Numbers of invasive cells and migration cells after exposed to different concentrations of oxygen in the Transwell migration assays(±s.n=5)

表2 不同濃度氧處理后穿透基底膜與游走遷移的細胞數(shù)Table 2.Numbers of invasive cells and migration cells after exposed to different concentrations of oxygen in the Transwell migration assays(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Migratory cells Invasive cells Control 99±2 80±9 1%O2 101±9 83±9 3%O2 134 ±9＊＊ 123 ±8＊＊5%O2 118±9* 99±10*

表3 CD44v6蛋白在HepG2細胞中的H－SCORE評分Table 3.The H-SCORE and the positive rate of CD44v6 in HepG2 cells(±s.n=5)

表3 CD44v6蛋白在HepG2細胞中的H－SCORE評分Table 3.The H-SCORE and the positive rate of CD44v6 in HepG2 cells(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group H-SCORE Positive rate(%)Control 2.85±0.46 91.70±1.51 1%O2 2.79±0.45 91.01±1.62 3%O2 3.54 ±0.39* 97.33 ±1.54＊＊5%O2 3.21±0.42 94.67±1.58*

5 HIF－1α和VEGF的表達變化

不同氧處理后應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測HIF-1α和VEGF的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)灰度密度的統(tǒng)計學(xué)分析，3%和5%氧處理組HIF-1α和VEGF的表達顯著增高(P＜0.05，n=5)，而1%氧處理組未見顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

討 論

Figure 4.Changes of the expression of MMP-9 and MMP-2 in cultured HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(gelatin zymography).C:control;1，2，3:1%，3%and 5%oxygen treatment group，respectively.±s.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖4 不同濃度氧處理HepG2細胞后MMP－9和MMP－2表達

缺氧是實體瘤微環(huán)境的基本特征之一［4］，同時也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因素。早有研究表明低氧可增加腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。由于腫瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)和功能異常所致的腫瘤細胞血供、氧供減少以及腫瘤細胞的快速增殖所致的腫瘤細胞氧耗增加，引起腫瘤細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，導(dǎo)致了腫瘤細胞的遺傳不穩(wěn)定性和惡性的選擇。原發(fā)性肝癌以生長迅速為特征，缺氧在肝癌細胞內(nèi)部尤其是巨塊型肝癌非常常見，肝動脈化療栓塞加重腫瘤內(nèi)部細胞缺氧的程度，殘存的缺氧腫瘤細胞可能改變其侵襲轉(zhuǎn)移特性。本實驗采用不同的低氧條件處理肝癌細胞24 h，研究腫瘤細胞的各項特性和相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果證實了低氧應(yīng)激使腫瘤細胞的黏附、穿透基底膜以及運動能力發(fā)生了不同程度的改變，其中以3%氧對肝癌細胞影響最大，其黏附能力、穿透基底膜以及運動能力均明顯增強，而1%氧反而降低肝癌細胞的黏附能力、運動能力以及穿透基底膜能力。該體外實驗結(jié)果提示適度缺氧不但不能殺死腫瘤細胞，反而可能促進腫瘤細胞的表型改變，導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移能力的增強。從臨床應(yīng)用角度，該結(jié)果提示肝動脈化療栓塞可能給肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了條件。由于肝癌組織的氧大部分來自肝動脈，但也有一部分來自門靜脈，在肝動脈化療栓塞后是否聯(lián)合門靜脈栓塞值得進一步探討和研究。

Figure 5.Changes of the expression of HIF-1α and VEGF in HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(RT-PCR).C:control;1，2，3:1%，3%and 5%oxygen treatment group，respectively.±s.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 不同濃度氧處理HepG2細胞后HIF－1α和VEGF的轉(zhuǎn)錄水平

腫瘤細胞對基底膜的黏附是實現(xiàn)腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一步，其黏附過程借助細胞膜上的黏附因子，其中CD44是目前研究較多的一種細胞黏附分子。它能與透明質(zhì)酸等多種配體分子結(jié)合，介導(dǎo)細胞與細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，通過黏附、遷移、滲透、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。CD44v6是最早被發(fā)現(xiàn)的含有變異型外顯子v6編碼序列的CD44分子，不少研究提示CD44v6可促進腫瘤細胞黏附與運動能力［5-6］。本實驗采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測了不同低氧應(yīng)激后肝癌細胞CD44v6表達的改變，結(jié)果顯示隨著氧濃度的減少，CD44v6的表達先增高后降低，其中3%氧對肝癌細胞的影響最大，1%氧處理后CD44v6的表達反而有所降低，提示適度的缺氧可上調(diào)CD44v6在肝癌細胞的表達。已有體外實驗顯示CD44v6參與了癌細胞與基底膜主要成分laminin和Ⅳ型膠原的黏附，其促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移可能與其促進了腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞、基底膜的黏附作用，同時提高了腫瘤細胞的遷移運動能力有關(guān)［5，7］。由此可見經(jīng)低氧應(yīng)激后人肝癌細胞對基底膜的黏附能力、穿透基底膜以及遷移運動能力的改變可能與CD44v6的表達改變有關(guān)。

此外，低氧在誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成中也有多種細胞因子參與［8］。已有多項研究表明，缺氧腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的改變可能與HIF-1α表達的增加密切相關(guān)，后者上調(diào)VEGF、MMP-9、MMP-2等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達［9-10］。這些因子由低氧誘導(dǎo)，如HIF-1α和VEGF，在遠端轉(zhuǎn)移前，器官依次誘導(dǎo)炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶表達，從而創(chuàng)造了一個易于使腫瘤細胞進入的良好環(huán)境，并改變了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［11］。本研究就HIF-1α、VEGF、MMP-9、MMP-2等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，觀察不同缺氧程度下這些相關(guān)因子的表達變化。結(jié)果顯示與侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變相平行，上述因子均表現(xiàn)為中度缺氧(3%氧)時表達上調(diào)，推測缺氧相關(guān)的腫瘤細胞侵襲力改變可能通過HIF-1α途徑上調(diào)下游轉(zhuǎn)移相關(guān)因子VEGF、MMP-9和MMP-2的表達，增強腫瘤細胞穿透基質(zhì)、運動等侵襲轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細胞即使在氧供應(yīng)充分時，也以糖無氧酵解形式獲取能量，在低氧環(huán)境下，這種糖酵解能力增強，進而導(dǎo)致線粒體功能障礙，產(chǎn)生更多中間代謝產(chǎn)物(如丙酮酸等)，后者可被腫瘤細胞利用以合成轉(zhuǎn)移相關(guān)因子及核酸等，從而促進腫瘤的生長［12］。因此，通過尋求一個合理靶點調(diào)控這一相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低MMPs的分泌和表達，有望降低因缺氧導(dǎo)致的腫瘤細胞侵襲能力增強，對肝癌的防治可能具有重大意義。但腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的多步驟過程，其中包括多種轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達的改變［13-14］，缺氧狀態(tài)下肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力改變的機制還有待進一步闡明。

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