鄭 輝， 薛 松， 連 鋒， 胡振雷， 汪永義

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院心胸外科，上海200127)

冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)是目前冠心病治療的主要手段，但是術(shù)后靜脈橋再狹窄嚴重影響了橋血管的遠期通暢率，已成為臨床上越來越棘手的問題。靜脈橋再狹窄的關(guān)鍵病變是內(nèi)膜增生[1]，涉及多種因素，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過度增殖并從中膜向內(nèi)膜遷移是重要的病理基礎(chǔ)，抑制VSMCs增殖和遷移是預(yù)防靜脈橋再狹窄發(fā)生的策略之一。隨著分子生物學及其技術(shù)的發(fā)展，基因治療逐漸成為防治靜脈橋再狹窄的焦點。生長終止特異性同源異型盒基因(growth arrest－specific homeobox gene，Gax)是近年來發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)細胞生物學行為的核轉(zhuǎn)錄因子基因，屬于同源異型盒基因家族，其通過與啟動子或增強子序列相結(jié)合，激活或抑制靶基因的表達，實現(xiàn)細胞生長、分化和遷移的基因調(diào)控作用[2]。有研究表明Gax基因在VSMCs中的表達模式類似于gas基因(growth arrest－specific gene)、gadd基因(growth arrest and DNA damage－inducible gene)，而gas/gadd基因家族對VSMCs增殖和遷移呈負性調(diào)節(jié)，Gax(hGax)基因這種特殊的表達特性漸漸受到人們的關(guān)注，成為血管成形術(shù)后再狹窄防治的新靶點。本研究以人Gax(hGax)基因為靶點，構(gòu)建其重組腺病毒載體并感染兔VSMCs，觀察hGax基因過表達對血清刺激后VSMCs增殖、遷移和細胞周期的影響，為靜脈橋再狹窄基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

兔血管平滑肌細胞、pEGFP－N1－h(huán)Gax、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，pDC318－mCMV質(zhì)粒和pPE3質(zhì)粒由上海第二軍醫(yī)大學錢其軍教授惠贈;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM和Trizol均購自Invitrogen;限制性內(nèi)切酶購自NEB;DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco;Taq酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa;病毒DNA抽提試劑盒、PCR回收試劑盒和DNA片段純化試劑盒均購自Qiagen;鼠抗人Gax單克隆抗體購自Abnova;MTT購自Sigma;PI購自上海生工試劑公司;所有引物均由上海博尚生物公司合成。

2 方法

2.1 高表達hGax的腺病毒載體的構(gòu)建與感染 采用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和Hind III對pEGFP－N1－h(huán)Gax質(zhì)粒進行雙酶切反應(yīng)，將酶切產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化hGax目的基因(片段大小為927 bp);然后將hGax基因片段與經(jīng)SpeⅠ和Hind III雙酶切消化后的pDC318－mCMV質(zhì)粒通過T4 DNA連接酶進行連接構(gòu)建成pDC318－mCMV－h(huán)Gax質(zhì)粒;轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板進行篩選，孵育過夜后，挑取陽性克隆菌落，搖菌后用堿裂解法提取質(zhì)粒，分別進行Hinc II和Kpn I、Sac I和Xho I雙酶切鑒定;酶切鑒定正確的克隆送至上海博尚生物技術(shù)公司進行DNA測序，將完全正確的質(zhì)粒命名為pDC318－mCMV－h(huán)Gax;然后將穿梭質(zhì)粒pDC318－mCMV－h(huán)Gax與骨架質(zhì)粒pPE3通過Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞以獲得含hGax基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，用病毒DNA抽提試劑盒提取腺病毒DNA，PCR法鑒定重組腺病毒載體是否含有hGax基因。hGax基因上游引物 5'－ATGGAACACCCGCTCTTTGGC －3'，下游引物 5'－ TCATAAGTGCGCATGCTCTGAG －3'。經(jīng)PCR鑒定正確的重組腺病毒載體命名為Ad5－h(huán)Gax，即攜帶人Gax基因的5型復(fù)制缺陷型腺病毒重組載體。經(jīng)擴增、純化后用Ad5－h(huán)Gax感染VSMCs，并設(shè)陰性對照組(即Ad5－EGFP感染VSMCs)和空白對照組(即PBS感染VSMCs)。

2.2 RT－PCR檢測轉(zhuǎn)染VSMCs hGax mRNA的表達 病毒感染細胞48 h后應(yīng)用Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度和A260/A280值，按常規(guī)行RTPCR。引物序列:hGax正義鏈 5'－ACCACCATCACCACCATCATC－3'，反義鏈 5'－ TGGAAGAGTTGGAGCACAGG－3'，擴增序列長度為174 bp;GAPDH正義鏈5'－GAACATCATCCCTGCCTCCAC －3'，反義鏈 5'－GCCTGCTTCACCACCTTCTTG －3'，擴增序列長度為183 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，95℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳、顯像、拍照。

2.3 免疫熒光染色法檢測轉(zhuǎn)染VSMCs hGax蛋白的表達 Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染VSMCs 48 h后，固定細胞并按常規(guī)免疫熒光染色方法進行，Ⅰ抗為1∶400鼠抗人Gax蛋白單克隆抗體，4℃孵育過夜后PBS洗滌。Ⅱ抗為1∶1 000 FITC標記羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，PBS洗滌后置熒光顯微鏡下觀察。

2.4 Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染對血清刺激VSMCs增殖的影響 按8×103cells/well接種于96孔板，細胞貼壁后進行干預(yù)，分別加入 Ad5－h(huán)Gax、Ad5－EGFP和PBS液，轉(zhuǎn)染4 h后用PBS液漂洗細胞去除病毒液，然后加入含1%FBS的 DMEM孵育12 h，換成含10%FBS的DMEM，使血清刺激VSMCs。分別于血清刺激 24 h、48 h、72 h、96 h 時，加入 20 μL MTT(5 g/L)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使甲瓚結(jié)晶完全溶解，酶標儀上以波長570 nm檢測各孔吸光度(A值)。抑制率(%)=(1－實驗組平均A值/空白對照組平均A值)×100%。

2.5 Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染對血清刺激VSMCs遷移的影響 取對數(shù)生長期VSMCs接種于培養(yǎng)皿，調(diào)整細胞濃度以致第2 d覆蓋達到約90%，實驗分組和病毒感染過程如上述，在培養(yǎng)皿底部做一直線標記，用無菌槍頭在無菌條件下沿標記線作劃痕，PBS液漂洗后加入含1%FBS的DMEM，孵育12 h后重新加入含10%FBS的DMEM，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h后各組鏡下隨機選取10個視野進行拍攝，測量兩邊細胞遷移邊緣之間的距離即劃痕寬度，取均值。

2.6 Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染對血清刺激VSMCs周期的影響 將VSMCs接種于培養(yǎng)皿，實驗分組、病毒感染和血清刺激方法同MTT實驗部分。血清刺激72 h后，消化并收集各組細胞，用4℃ 70%乙醇固定，RNA酶37℃下消化30 min，PI避光染色，300目篩網(wǎng)過濾后樣本加入流式細胞儀分析細胞周期。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 含hGax基因的復(fù)制缺陷型腺病毒重組載體的鑒定

經(jīng)Sac I和 Xho I雙酶切，pDC318－mCMV－h(huán)Gax質(zhì)粒切出319 bp、791 bp和3 728 bp 3條片段，與預(yù)期的酶切結(jié)果完全相符，見圖1。經(jīng)Hinc II和Kpn I雙酶切，pDC318－mCMV－h(huán)Gax質(zhì)粒切出401 bp、596 bp、1 846 bp 和1 995 bp 4 條片段，與預(yù)期結(jié)果完全相同，見圖2。DNA測序結(jié)果示pDC318－mCMV－h(huán)Gax質(zhì)粒中的人Gax基因序列與GenBank中公布的基因序列基本一致。PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖示在927 bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的hGax基因片段大小相符，見圖3。說明成功構(gòu)建了含hGax基因的復(fù)制缺陷型腺病毒重組載體。

2 RT－PCR分析

瓊脂糖凝膠電泳圖示，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染的VSMCs中hGax mRNA表達呈陽性條帶(174 bp)，而Ad5－EGFP轉(zhuǎn)染組無相應(yīng)陽性條帶，表明在mRNA水平上目的基因hGax成功轉(zhuǎn)染入VSMCs，見圖4。

Figure 1.The double digestion identification of pDC318－mCMV－ hGax.M:DNA marker;Lane 1，2:Sac I and Xho I digestion.圖1 pDC318－mCMV－h(huán)Gax質(zhì)粒的Sac I和Xho I雙酶切鑒定

3 免疫熒光染色分析

Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染48 h后，免疫熒光染色結(jié)果示VSMCs內(nèi)呈紅色陽性表達，尤以胞核為主，即為hGax蛋白，而對照組細胞內(nèi)未見相應(yīng)的染色，提示VSMCs經(jīng)Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染后有外源性hGax蛋白過表達，見圖5。

Figure 4.RT－PCR result of the hGax mRNA expression.M:DNA marker;Lane 1:Ad5－EGFP－transfected cells;Lane 2:Ad5－h(huán)Gax－transfected cells.圖4 hGax mRNA表達的RT－PCR檢測結(jié)果

Figure 5.The hGax protein expression in the Ad5－h(huán)Gax－transfected cells.A:hGax protein expression in the cells 48 h after Ad5－h(huán)Gax transfection under fluorescent microscope(×100);B:EGFP protein expression in the cells 48 h after Ad5－EGFP transfection(negative control group)under fluorescent microscope(×100);C:VSMCs 48 h after PBS treatment(blank control group)under inverted microscope(×100).圖5 hGax蛋白在Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染后的細胞中表達

4 細胞增殖分析

MTT法結(jié)果表明(表1)，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染組中血清刺激后VSMCs體外增殖受到明顯抑制，與陰性對照組和空白對照組(各時點為0)相比有顯著差異(P＜0.05)，且隨培養(yǎng)時間的延長細胞生長抑制率升高，見圖6，而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異，說明hGax基因過表達能顯著抑制血清刺激后兔VSMCs增殖。

表1 hGax蛋白對血清刺激后VSMCs增殖的影響Table 1.Effect of hGax protein expression on the proliferation of serum－induced VSMCs in different groups at different time points(±s.n=5)

表1 hGax蛋白對血清刺激后VSMCs增殖的影響Table 1.Effect of hGax protein expression on the proliferation of serum－induced VSMCs in different groups at different time points(±s.n=5)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group 24 h 48 h 72 h 96 h Blank control 0.303 ±0.033 0.350 ±0.025 0.440±0.006 0.473 ±0.012 Ad5 －EGFP 0.295 ±0.029 0.348 ±0.016 0.438 ±0.008 0.467 ±0.014 Ad5 －h(huán)Gax 0.251 ±0.032 0.260 ±0.015*0.275 ±0.007*0.283 ±0.007*

Figure 6.Effect of hGax overexpression on proliferation inhibitory rates of serum－induced rabbit VSMCs at different time points.±s.n=3.*P＜0.05 vs 24 h.圖6 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs生長抑制率的影響

5 細胞遷移分析

劃痕法檢測結(jié)果顯示(表2)，0 h時劃痕寬度均為(450.81 ±7.17)μm，空白對照組中劃痕寬度在不同時點上與陰性對照組相比差異無顯著，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度較對照組明顯延長(P＜0.05)，即該組細胞的遷移能力顯著減弱，說明hGax基因過表達能顯著抑制血清刺激后兔VSMCs遷移。

表2 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs遷移的影響Table 2.Effect of hGax gene overexpression on the migration of serum－induced rabbit VSMCs(μm.±s.n=10)

表2 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs遷移的影響Table 2.Effect of hGax gene overexpression on the migration of serum－induced rabbit VSMCs(μm.±s.n=10)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group 24 h 48 h 72 h Blank control 265.548 ±12.498 225.582 ±7.961167.385 ±9.790 Ad5 －EGFP 260.548 ±11.498 222.582 ±8.761 164.385 ±7.790 Ad5 －h(huán)Gax 361.643 ±9.730* 317.582 ±9.901*289.385 ±10.783*

6 流式細胞儀分析

流式檢測結(jié)果顯示，血清刺激72 h后，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染組中G0/G1期VSMCs比例增高，G2/M+S期細胞減少，與空白對照組和陰性對照組相比差異顯著;而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異，見表3、圖7。

表3 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs細胞周期分布的影響Table 3.The effects of hGax gene overexpression on cell cycle distribution of serum－induced rabbit VSMCs(%.±s.n=3)

表3 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs細胞周期分布的影響Table 3.The effects of hGax gene overexpression on cell cycle distribution of serum－induced rabbit VSMCs(%.±s.n=3)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group G0/G1 G2/M+S Blank control 44.17 ±2.0555.83 ±2.05 Ad5 － EGFP 42.57 ±2.4557.43 ±2.45 Ad5 － hGax 66.65 ±3.75*33.35 ±3.75*

Figure 7.Effect of adenovirus－ mediated hGax gene transfection on cell cycle of induced rabbit VSMCs.圖7 Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染對血清刺激后兔VSMCs細胞周期的影響

討 論

靜脈橋再狹窄實質(zhì)上是自體大隱靜脈為適應(yīng)動脈循環(huán)中的壓力而發(fā)生的血管重塑。Manabe等[3]研究表明VSMCs是新生內(nèi)膜的主要成分之一，其異常增殖和遷移在移植血管病理性重塑過程中起重要作用。胎牛血清作為一種復(fù)合型的營養(yǎng)物質(zhì)，主要含有血小板源生長因子、堿性成纖維生長因子和溶血磷脂酸等成分，血小板源生長因子作為VSMCs的促絲分裂劑和趨化劑，對血管增殖性病變起重要作用[4];堿性成纖維生長因子可刺激血管內(nèi)皮細胞和VSMCs增殖。本實驗應(yīng)用血清刺激體外培養(yǎng)的VSMCs模型來模擬部分體內(nèi)過程，對于防治靜脈橋再狹窄的研究具有重要意義。

同源盒基因在核苷酸序列水平上含有一段約180 bp的高度保守序列，編碼60個氨基酸，稱為同源結(jié)構(gòu)域，其中含有的螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋結(jié)構(gòu)可識別以5’－TAAT－3’為核心10～12 bp的 DNA序列，并且與DNA形成特異性結(jié)合，而其N－末端臂與DNA小溝的接觸能起到穩(wěn)定結(jié)合的作用。同源盒基因編碼的蛋白通過這種結(jié)合方式對下游靶基因的表達進行調(diào)節(jié)，從而控制細胞生長、分化。Gax基因是Gorski等[5]在1993年克隆出1個主要存在于心血管系統(tǒng)的同源盒基因，其編碼蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子。除保守的同源結(jié)構(gòu)域外，Gax蛋白含有特殊的CAX重復(fù)結(jié)構(gòu)，其對細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)具有重要作用。Gax基因高表達于靜止期血管內(nèi)皮細胞和VSMCs。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)血管外膜成纖維細胞正常狀態(tài)下表達Gax蛋白，并且Gax基因過表達可顯著減少S期細胞，增加G0－G1期細胞，從而抑制其增殖;經(jīng)研究驗證在絲裂原刺激或血管損傷后VSMCs中的 Gax 基因表達迅速下降[5，7]，表明 Gax 基因在維持非增殖狀態(tài)VSMCs中起重要調(diào)節(jié)作用;Yamashita等[8]研究表明Gax是血管緊張素Ⅱ和C型鈉尿肽調(diào)節(jié)VSMCs增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的共同轉(zhuǎn)錄因子，前者表現(xiàn)為促進VSMCs增殖，后者則抑制VSMCs增殖;此外，細胞表型轉(zhuǎn)化是血管增生性疾病中VSMC增殖和遷移的關(guān)鍵起始步驟[9]，因而維持收縮型 VSMCs顯得至關(guān)重要，Markmann等[10]報道Gax是調(diào)節(jié)VSMCs收縮型與合成型之間相互轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)基因之一。

為明確Gax基因?qū)ρ宕碳ず骎SMCs增殖、遷移和周期的影響，通過過表達Gax基因，檢測細胞增殖、遷移和周期的變化是可行的有效方法，這將為以Gax基因作為候選基因，進行靜脈橋再狹窄基因治療提供一定的實驗依據(jù)。同時，基于復(fù)制缺陷型腺病毒載體的優(yōu)勢和對VSMCs具有高親和性[11]，作為介導(dǎo)血管系統(tǒng)的過表達載體比較理想。通過復(fù)制缺陷型腺病毒介導(dǎo)的Gax基因可能是靜脈橋再狹窄防治的有效方法。本研究中，通過含hGax基因復(fù)制缺陷型腺病毒過表達載體轉(zhuǎn)染 VSMCs，轉(zhuǎn)染48 h后，hGax在mRNA水平上和蛋白水平上均有顯著表達，說明轉(zhuǎn)染成功，導(dǎo)入的目的基因hGax在VSMCs內(nèi)成功表達。

本實驗通過MTT法檢測各組血清刺激后VSMCs的增殖活性，結(jié)果顯示，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染組中的VSMCs生長速度明顯減慢，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異，并且隨著血清刺激時間的延長而降低。Gorski等[12]研究表明Gax基因可通過激活細胞周期蛋白激酶抑制劑P21活性來抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖。細胞增殖是由細胞周期控制的[13]。本實驗應(yīng)用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染72 h后細胞周期變化的結(jié)果顯示，Ad5－h(huán)Gax轉(zhuǎn)染組中G0/G1期細胞顯著多于對照組，G2/M+S期明顯減少，統(tǒng)計學上差異顯著，提示Gax基因過表達可能通過細胞周期限制點使VSMCs處于靜止期來抑制細胞增殖。

本研究的劃痕實驗結(jié)果顯示hGax基因過表達可明顯抑制血清刺激后VSMCs遷移，與對照組比較有統(tǒng)計學差異，而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異。VSMCs遷移涉及細胞表型轉(zhuǎn)化、局部黏附激酶、細胞骨架蛋白等多種因素。Witzenbichler等[14]研究發(fā)現(xiàn) Gax 基因通過抑制整合素 αγβ3、αγβ5表達來調(diào)節(jié)化學趨化因子誘導(dǎo)的 VSMCs遷移。但是Gax基因?qū)SMCs遷移抑制效應(yīng)所通過的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚無定論，仍需更深一步研究。

總之，本研究將含hGax基因的重組腺病毒載體感染兔VSMCs，獲得過表達hGax基因的VSMCs。通過對細胞增殖、遷移和細胞周期的研究發(fā)現(xiàn):腺病毒介導(dǎo)的hGax基因過表達能有效抑制血清刺激后VSMCs的增殖和遷移;這可能通過阻滯細胞周期進展來實現(xiàn)。

[1]Muto A，Model L，Ziegler K，et al.Mechanisms of vein graft adaptation to the arteria circulation:insights into the neointimal algorithm and management strategies[J].Circ J，2010，74(8):1501－1512.

[2]Patel S，Leal AD，Gorski DH.The homeobox gene Gax inhibits angiogenesis through inhibition of nuclear factorκB － dependent endothelial cell gene expression[J].Cancer Res，2005，65(4):1414 －1424.

[3]Manabe I，Nagai R.Regulation of smooth muscle phenotype[J].Curr Atheroscler Rep，2003，5(3):214 －222.

[4]Li J，Huang SL，Guo ZG.Platelet derived growth factor stimulated vascular smooth muscle cell proliferation and its molecular mechanism[J].Acta Pharmacol Sin，2000，21(4):340－344.

[5]Gorski DH，Lepage DF，Patel CV，et al.Molecular cloning of a diverged homeobox gene that is rapidly down－regulated during the G0/G1transition in vascular smooth muscle cells[J].Mol Cell Biol，1993，13(6):3722 －3733.

[6]Liu P，Zhang C，F(xiàn)eng JB，et al.Cross talk among Smad，MAPK，and integrin signaling pathways enhances adventitial fibroblast functions activated by transforming growth factor－ β1 and inhibited by Gax[J].Aterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(4):725 －731.

[7]Weir L，Chen D，Pastore C，et al.Expression of Gax，a growth arrest homeobox gene，is rapidly down－regulated in the rat carotid artery during the proliferative response to balloon injury[J].J Biol Chem，1995，270(10):5457－5461.

[8]Yamashita J，Itoh H，Ogawa Y，et al.Opposite regulation of Gax homeobox expression by angiotension II and C－type natriuretic peptide[J].Hypertension，1997，29(1 Pt 2):381 －387.

[9]周志斌，張志珺.溶血磷脂酸與血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化[J].中國病理生理雜志，2009，25(6):1228－1231.

[10]Markmann A，Rauterberg J，Vischer P，et al.Expression of transcription factors and matrix genes in response to serum stimulus in vascular smooth muscle cells[J].Eur J Cell Biol，2003，82(3):119 －129.

[11]Kremer EJ，Perricaudet M.Adenovirus and adeno－associated virus mediated gene transfer[J].Br Med Bull，1995，51(1):31 －44.

[12]Gorski DH，Alejandro J，Leal BS.Inhibition of endothelial cell activation by the homeobox gene Gax[J].J Surg Res，2003，111(1):91 －99.

[13]Tanner FC，Yang ZY，Duckers E，et al.Expression of cyclin － dependent kinase inhibitors in vascular disease[J].Circ Res，1998，82(3):396 －403.

[14]Witzenbichler B，Kureishi Y，Luo Z，et al.Regulation of smooth muscle cell migration and integrin expression by the Gax transcription factor[J].J Clin Invest，1999，104(10):1469－1480.