林旭紅， 李永渝， 馮雅靜， 曹明華， 徐 菁， 李 琨， 馮佳燕， 余良英

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，同濟(jì)大學(xué)消化系統(tǒng)疾病研究所，上海200092)

大麻類(lèi)物質(zhì)包括植物大麻或其提取物，在治療胃腸道疾病方面具有悠久的歷史，但由于精神方面的副作用，限制了它們的應(yīng)用。近10年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，大麻類(lèi)物質(zhì)藥理效應(yīng)的生物化學(xué)基礎(chǔ)已逐漸得到認(rèn)識(shí)，不少作用專(zhuān)一、副作用小的大麻類(lèi)新制劑不斷被研制出來(lái)。目前已報(bào)道的大麻制品有60多種，它們與內(nèi)源性大麻素(cannabinoid，CB)一樣，主要通過(guò)大麻素1型(cannabinoid-1，CB1)受體和大麻素2型(cannabinoid-2，CB2)受體介導(dǎo)，發(fā)揮對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)、免疫功能、食欲控制、上皮生長(zhǎng)和再生的調(diào)控作用，其中CB受體在胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)方面的作用已得到廣泛認(rèn)可［1-3］，本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，CB1受體參與生理及病理生理?xiàng)l件下大鼠、小鼠胃腸道運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)，CB2受體調(diào)控胃腸道運(yùn)動(dòng)僅限于胃腸道的某些區(qū)域或某些疾病狀態(tài)［4］。

隨著對(duì)大麻制劑研究的不斷深入，最近在哺乳類(lèi)發(fā)現(xiàn)一種與CB1和CB2受體具有同源序列［5-6］、并表達(dá)與CB配體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體 55(G-protein-coupled receptor 55，GPR55)，它能被一些 CB配體激活［7-8］，因此認(rèn)為 GPR55是一種新的CB受體。針對(duì)這種新的CB受體的配體大麻二酚(cannabidiol，CBD)和O-1602是2種典型的非精神性新型大麻制劑，它們的毒副作用小，具有一定的抗炎作用，但與胃腸運(yùn)動(dòng)的關(guān)系仍不清楚。本文通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)研究，探討O-1602和CBD對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠、小鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂的影響;在此基礎(chǔ)上，用Western blotting檢測(cè)GPR55蛋白表達(dá)情況，ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)及白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)水平，采用傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)觀察O-1602和CBD對(duì)平滑肌細(xì)胞膜電位的影響，用定磷法測(cè)定平滑肌組織Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)的活性，旨在闡明其作用機(jī)制，為其可能的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 在體實(shí)驗(yàn)

1.1 動(dòng)物及分組 8～10周C57BL小鼠(18～20 g)36只，雌雄各半，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，隨機(jī)分為6組:對(duì)照組、感染性腸紊亂組、CBD組、O-1602組、CBD+LPS組和O-1602+LPS組。參照Li等［4］的方法制備感染性腸運(yùn)動(dòng)紊亂模型，即小鼠腹腔注射LPS組400 μg/kg。對(duì)照組以等體積生理鹽水代替LPS，CBD+LPS組和O-1602+LPS組在造模前10 min腹腔分別注射1 mg/kg CBD和1 mg/kg O-1602。

1.2 小鼠上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)功能測(cè)定 參照前期實(shí)驗(yàn)方法［4］檢測(cè)不同處理組小鼠小腸的排推功能。即:單獨(dú)注射藥物30 min或合用LPS后，小鼠每10 g體重灌胃0.1 mL碳末懸液。灌胃后20min頸椎脫臼處死動(dòng)物，馬上移除幽門(mén)至盲腸段小腸，測(cè)量碳末移行的距離，計(jì)算碳末占整個(gè)小腸的百分比，結(jié)果表示為各組小腸排推率占對(duì)照組的百分比。同時(shí)心臟取血，離心取血清，留取回腸迅速投入-80℃冰箱備用。

1.3 Western blotting法測(cè)定小鼠小腸GPR55蛋白含量 取小鼠回腸組織加入蛋白裂解液［組成:HEPES 25 mmol/L(pH 7.5)，EDTA 1 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，MgCl210 mmol/L，PMSF 1 mmol/L，加入1%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40，NP-40)，2%甘油(glycerol)，10 mg/L抑肽酶(aprotinin)］，勻漿，充分裂解后離心取上清液，檢測(cè)樣品蛋白濃度(BCA，上海申能博彩)。等濃度樣品加入5×上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)，95℃煮沸10 min使蛋白變性。將樣品(40 μg蛋白)在4%～10%Tris-SDS-PAGE膠中電泳1.5 h，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，滴加GPR55多克隆抗體(1∶500 稀釋?zhuān)珻aymen Chemical)，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000稀釋?zhuān)痊斕厣镝t(yī)藥上海有限公司)，室溫孵育 1 h，用 ImageQuant LAS4000 Mini化學(xué)發(fā)光成像分析儀檢測(cè)蛋白條帶，內(nèi)參照用β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋?zhuān)琒igma)檢測(cè)。

1.4 血清TNF-α和IL-6水平檢測(cè) 按ELISA試劑盒(R＆D)說(shuō)明書(shū)步驟操作。

2 離體實(shí)驗(yàn)

2.1 動(dòng)物及分組 在自發(fā)性收縮實(shí)驗(yàn)(200～250 g雄性SD大鼠36只，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物中心)、電刺激誘導(dǎo)的收縮實(shí)驗(yàn)(18～20 g C57BL小鼠36只，購(gòu)自Charles River)、膜電位實(shí)驗(yàn)(18～20 g雄性ICR小鼠36只，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物中心)和Ca2+-AT-Pase測(cè)定實(shí)驗(yàn)(18～20 g雄性ICR小鼠36只，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物中心)中各隨機(jī)分為6大組:對(duì)照組、感染性腸運(yùn)動(dòng)紊亂組、CBD組(10-9mol/L～10-7mol/L)、O-1602組(10-9mol/L～10-7mol/L)、CBD+LPS(10-9mol/L～10-7mol/L)組和O-1602+LPS組(10-9mol/L～10-7mol/L)。

2.2 器官浴槽記錄大鼠回腸自發(fā)性收縮 大鼠禁食12 h，麻醉下頸椎脫臼處死，迅速取出近端回腸，參照Bashashati等［9］的方法制備回腸肌條。肌條在1 g的前負(fù)荷下收縮，標(biāo)本至少穩(wěn)定60 min(每隔15 min用新鮮37℃ Kreb’s液沖洗肌條)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

待肌條自發(fā)收縮活動(dòng)平穩(wěn)后開(kāi)始向浴槽內(nèi)加藥，包括單獨(dú)加 LPS，再進(jìn)行O-1602(10-9mol/L、10-8mol/L 和 10-7mol/L)或 CBD(10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L)分別與LPS(1.5 mg/L)共孵育的研究(非累積性給藥)，觀察肌條收縮情況的變化。每種藥物濃度觀察20 min，再加入下一個(gè)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，加入10-4mol/L乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)檢測(cè)組織反應(yīng)性，選擇反應(yīng)良好的肌條進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用SMUP-E4生物電信號(hào)處理系統(tǒng)(上海嘉龍教學(xué)儀器廠)記錄組織收縮情況，以加藥前5 min作為對(duì)照反應(yīng)，結(jié)果表示為加藥后15～20 min內(nèi)平滑肌收縮活動(dòng)平均振幅的變化(g)。

2.3 小鼠電刺激誘導(dǎo)的收縮活性 回腸肌條制備同上，肌條的一端固定于肌槽底部與電極夾相連的掛鉤上，另一端穿過(guò)2個(gè)相距0.6 cm的環(huán)形鉑電極，以絲線連接張力換能器。標(biāo)本平衡后開(kāi)始進(jìn)行電刺激，分別選 1 Hz、2 Hz、5 Hz、10 Hz、20 Hz 和 50 Hz，刺激參數(shù)為:每種頻率連續(xù)2次用恒定電壓脈沖40 V、0.5 ms刺激，每5 min一次，每次持續(xù)10 s。加藥方法同前，平滑肌收縮變化用Hellige耦合器和放大器(Orbeco-Hellige)放大，用Spike軟件記錄。加藥前連續(xù)3次電刺激誘導(dǎo)的收縮均值作為對(duì)照反應(yīng)，結(jié)果表示為加藥后15～20 min內(nèi)平滑肌收縮活動(dòng)平均振幅的變化(g)。

2.4 小鼠回腸平滑肌細(xì)胞膜電位及慢波的記錄同上處死小鼠取出小腸，在碳酸氫鹽緩沖液中沿腸系膜側(cè)剪開(kāi)小腸。在體視顯微鏡下去除粘膜層，制備空腸平滑肌組織(2 mm寬，5 mm長(zhǎng))，將組織固定于硅膠板，置于組織浴槽底部，孵育在37℃ Kreb’s液，充以氧氣和二氧化碳，以2 mL/min的速度持續(xù)灌流，穩(wěn)定2 h。采用傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄平滑肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)電反應(yīng)［10］包括膜電位(membrane potential，Em)和慢波。具體方法如下:將尖端直流阻抗為50～80 MΩ，充滿0.5 mol/L KCl的玻璃微電極［外直徑1.5 mm，內(nèi)直徑0.84 mm，拉制參數(shù):加熱溫度(heater)9.25，亞磁力(megnet)6，磁力(main megnet)9］固定在微電極操縱器上，調(diào)節(jié)操縱器，將電極尖端推進(jìn)至標(biāo)本表面，刺入細(xì)胞，記錄電反應(yīng)，所記錄的慢波電位通過(guò)高輸入阻抗放大器放大信號(hào)。在獲得小鼠小腸平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)膜電位活動(dòng)后，在灌流液中加入不同濃度的O-1602、CBD或LPS，或LPS與以上大麻制劑同用，觀測(cè)其對(duì)膜電位活動(dòng)及慢波的影響。

2.5 小鼠回腸平滑肌組織Ca2+-ATPase測(cè)定 同上制備小鼠平滑肌肌條，精確稱(chēng)重組織，以0.9%生理鹽水稀釋制成10%勻漿，分別于250 μL回腸平滑肌組織勻漿液中加入各組藥物，使CBD和O-1602終濃度分別為10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol/L，LPS終濃度為1.5 mg/L。反應(yīng)2 min后，加入2.5%戊二醛100 μL，終止反應(yīng)，根據(jù)預(yù)試結(jié)果，樣本稀釋10倍進(jìn)行酶促反應(yīng)，檢測(cè) Ca2+-ATPase(南京建成生物科技有限公司)，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)用BCA蛋白定量試劑盒(上海申能博彩)測(cè)定組織蛋白濃度。以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位［即 mmolPi·(g protein)-1·h-1］，公式:ATPase 活力［103U·(g protein))-1］=［(測(cè)定管A值-對(duì)照管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值)］×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.02 mmol·L-1)×6×10/蛋白濃度(g protein·L-1)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉ±sE)表示，先用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若樣本所來(lái)自總體符合方差齊性要求，則對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，隨后再進(jìn)行Dunnett’s檢驗(yàn)分析;若樣本所來(lái)自總體的方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠小腸排推功能的改變

對(duì)照組小鼠小腸推進(jìn)率為100%，O-1602和CBD腹腔注射均不影響正常小鼠上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)，而LPS非常顯著減慢上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)(74.2% ±3.6%，P＜0.05)，說(shuō)明在感染狀態(tài)下，胃腸傳輸功能明顯下降，表現(xiàn)為傳輸速度較正常組顯著減慢。CBD預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)減慢(124.5%±9.4%，P＜0.05)，見(jiàn)表1，O-1602未發(fā)揮明顯的拮抗效應(yīng)。

表1 O－1602或CBD對(duì)小鼠上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響Table 1.Effect of O-1602 or CBD on upper gastrointestinal(GI)transit in mice(%.±sE.n=6)

表1 O－1602或CBD對(duì)小鼠上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響Table 1.Effect of O-1602 or CBD on upper gastrointestinal(GI)transit in mice(%.±sE.n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.

Treatment Upper GI transit Control 100.0±6.5 CBD 102.2±7.0 O-1602 106.2±4.5 LPS 66.6±3.6*CBD+LPS 116.7±9.4#O-1602+LPS 89.5±3.9

2 小鼠回腸組織中GPR55蛋白的表達(dá)

與未處理組比較，O-1602和CBD單獨(dú)應(yīng)用均不影響小鼠回腸GPR55蛋白表達(dá)，腹腔注射LPS后，回腸組織GPR55蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)，CBD預(yù)處理顯著降低LPS導(dǎo)致的GPR55表達(dá)的升高(P＜0.01)，O-1602對(duì)LPS的效應(yīng)則無(wú)明顯作用，見(jiàn)圖1。

3 血清TNF－α和IL－6水平的變化

如圖2所示，腹腔注射LPS后，小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高(P＜0.01)，提示LPS處理后促炎機(jī)制被激活。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)O-1602對(duì)2種細(xì)胞因子水平均無(wú)明顯影響(P＞0.05)，CBD拮抗LPS導(dǎo)致的大鼠血清IL-6水平升高(P＜0.01)，但不影響TNF-α水平(P＞0.05)。

Figure 1.Effect of O-1602 or CBD on the expression of GPR55 protein in mice ileum.±sE.n=6.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS group.圖1 O－1602或CBD對(duì)小鼠回腸GPR55蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.Effect of CBD or O-1602 on the levels of TNF-α(A)and IL-6(B)in serum of mice.±sE.n=6.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS.圖2 CBD或O－1602對(duì)小鼠血清TNF－α和IL－6的影響

4 大鼠回腸自發(fā)性收縮活動(dòng)的變化

10-9mol/L和10-8mol/L O-1602均不影響回腸收縮，而10-7mol/L O-1602明顯抑制回腸自發(fā)性收縮，與對(duì)照組相比，下降至67.9% ±8.7%，P＜0.05，見(jiàn)圖3A，但對(duì)LPS抑制回腸收縮無(wú)明顯作用。單獨(dú)應(yīng)用LPS抑制大鼠回腸自發(fā)性收縮，與對(duì)照組相比，下降至59.5%±7.4%，P＜0.01，見(jiàn)圖3B。

CBD對(duì)正常肌條自發(fā)性收縮無(wú)明顯影響，但LPS造模前、后10 min應(yīng)用CBD(劑量為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)可阻斷 LPS對(duì)回腸自發(fā)性收縮的效應(yīng)，即逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)回腸收縮的抑制，從LPS組59.5% ±7.4%分別升高至79.7% ±6.1%，P＜0.05;99.1% ±3.7%，P＜0.01;96.3% ±8.3%，P＜0.01，見(jiàn)圖3B。

Figure 3.Effect of O-1602 on the spontaneous contraction of the isolated rat uleum(A)and effect of CBD on LPS-induced contraction disturbances in the isolated rat ileum(B).±sE.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control，#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS.圖3 O－1602對(duì)大鼠回腸自發(fā)性收縮的影響和CBD對(duì)LPS導(dǎo)致的大鼠回腸收縮紊亂的影響

5 電刺激誘導(dǎo)的小鼠回腸收縮的變化

電刺激引起小鼠回腸規(guī)律性的相位性收縮，隨著刺激頻率的增高，收縮振幅逐漸升高，10 Hz～20 Hz刺激時(shí)變化最明顯，至50 Hz時(shí)達(dá)到最大收縮，見(jiàn)圖4。我們選用10 Hz作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。單獨(dú)應(yīng)用O-1602使收縮幅度分別降至86.6%±11.7%、82.2%±9.0%和76.9%±10.3%(P＞0.05，P＞0.05，P＜0.05)，但CBD不影響這種收縮活動(dòng)，見(jiàn)圖5。而模型組失去這種收縮模式，腸蠕動(dòng)明顯加速，見(jiàn)圖6，LPS組在用藥后5 min時(shí)收縮力即開(kāi)始升高，而且收縮的改變隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯，至30 min時(shí)與對(duì)照組比，升至179.0%±12.7%(P＜0.01)。如圖6所示，O-1602加入LPS預(yù)處理的回腸肌條孵育后，在有效濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性抑制LPS對(duì)腸段收縮的促進(jìn)作用(167.9% ±18.1%，P＜0.05;150.1%±16.7%，P＜0.01;142.3%±15.5%，P＜0.01);CBD對(duì)LPS導(dǎo)致的胃腸運(yùn)動(dòng)紊亂的影響與O-1602類(lèi)似，其對(duì)腸段收縮的抑制程度分別為156.5%±13.2%(P＜0.01)、156.3%±12.0%(P＜0.01)和153.2% ±10.9%(P＜0.01)。

Figure 4.Electrically-evoked frequency-dependent contraction of mouse ileum.±sE.n=6.圖4 電刺激誘導(dǎo)的小鼠回腸頻率依賴性收縮

Figure 5.Effect of O-1602 or CBD on electrically-evoked(10 Hz)contraction of mouse ileum.±sE.n=6.*P＜0.05 vs control.圖5 O－1602或CBD對(duì)10 Hz電刺激誘導(dǎo)的小鼠回腸收縮的影響

6 小鼠回腸平滑肌細(xì)胞膜電位及慢波的變化

各濃度的O-1602和CBD對(duì)小鼠回腸平滑肌細(xì)胞膜電位無(wú)明顯影響(P＞0.05)，慢波振幅也沒(méi)有顯著改變(P＞0.05);在LPS處理的回腸組織，O-1602和CBD對(duì)降低的平滑肌細(xì)胞膜電位均無(wú)明顯作用(P＞0.05)。

7 小鼠回腸平滑肌組織Ca2+－ATPase活性的變化

如圖7所示，正常小鼠平滑肌組織Ca2+-ATPase活性為(4.7±0.6)×103U· (g protein)-1，高濃度(10-7mol/L)O-1602明顯增強(qiáng)平滑肌組織肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性［(17.6±1.4)×103U· (g protein)-1，P＜0.01］，而各濃度CBD 均不影響 Ca2+-ATPase活性;LPS處理后，其平滑肌組織 Ca2+-ATPase活性顯著增強(qiáng)［(29.7±6.9)×103U·(g protein)-1，P＜0.01］，單獨(dú)以各濃度CBD預(yù)處理后，10-8mol/L和10-7mol/L均可逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)平滑肌組織Ca2+-ATPase活性的升高效應(yīng)，與LPS組相比，差異顯著［分別為(16.4±5.9)×103U·(g protein)-1和(14.6±3.5)×103U·(g protein)-1，P ＜0.05］。O-1602對(duì)LPS升高平滑肌細(xì)胞Ca2+-ATPase活性的作用無(wú)明顯影響(P＞0.05)。

Figure 6.Effect of O-1602 or CBD on LPS-induced electrically-evoked contraction disorder of mouse ileum. ± sE.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS.圖6 O－1602或CBD對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠回腸電刺激收縮紊亂的影響

討 論

胃腸道(gastrointestine，GI)運(yùn)動(dòng)紊亂發(fā)生于多種情況，是多種不同病因和發(fā)病機(jī)制所導(dǎo)致的一系列疾病的共同表現(xiàn)，尤其是炎癥相關(guān)GI疾病引起的小腸運(yùn)動(dòng)紊亂，常導(dǎo)致GI內(nèi)過(guò)度增殖的腸道病原菌釋放腸毒素，由此加重GI運(yùn)動(dòng)紊亂。因此對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探究及有效治療藥物的尋求一直是這一領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。

在體LPS模型被經(jīng)常用來(lái)作為大、小鼠感染性腸運(yùn)動(dòng)紊亂模型［11］，我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上，采用400 μg/kg腹腔注射復(fù)制小腸運(yùn)動(dòng)紊亂模型，結(jié)果表明，小鼠小腸運(yùn)動(dòng)明顯受損，表現(xiàn)為上消化道轉(zhuǎn)運(yùn)功能明顯抑制。多項(xiàng)研究［12-14］表明，電刺激導(dǎo)致肌肉穩(wěn)定的單相收縮，這種收縮反應(yīng)是由膽堿能和神經(jīng)介導(dǎo)的由乙酰膽堿從腸神經(jīng)釋放引起的，因?yàn)檫@種反應(yīng)被阿托品和河豚毒素完全阻斷，通過(guò)觀察體外小鼠回腸與LPS共孵育時(shí)平滑肌收縮振幅的改變，我們發(fā)現(xiàn)在10 Hz刺激頻率下，LPS明顯促進(jìn)小鼠回腸平滑肌收縮，這一效應(yīng)發(fā)生快，并有明顯的時(shí)間依賴性，至30min時(shí)達(dá)到高峰，這在 Duncan等［12］和Bashashati等［9］的研究中得到證實(shí)。而在自發(fā)性收縮的研究中，相同濃度的LPS明顯抑制大鼠回腸平滑肌收縮，說(shuō)明不同收縮方式對(duì)LPS顯示不同的反應(yīng)。較多研究認(rèn)為，LPS導(dǎo)致腸運(yùn)動(dòng)紊亂的機(jī)制主要涉及促炎介質(zhì)損傷肌肉收縮和/或降低肌層神經(jīng)叢神經(jīng)遞質(zhì)釋放［15-17］，LPS通過(guò)激活腸肌層及腸外肌層大量巨噬細(xì)胞，分泌眾多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步影響胃腸道運(yùn)動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)中也見(jiàn)到LPS處理的小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高。

研究表明，多種CB制劑可用來(lái)治療胃腸道動(dòng)力相關(guān)疾病，并主要通過(guò)CB1、CB2受體發(fā)揮作用，但由于其同時(shí)激活腦內(nèi)CB1受體引起精神作用，限制了它們?cè)谂R床的應(yīng)用。在過(guò)去的幾年中，大麻類(lèi)物質(zhì)對(duì)GPR55的藥理作用已得到深入研究，然而還存在爭(zhēng)議［18］，并且沒(méi)有充足證據(jù)證明位于腸道的GPR55的功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GPR55 mRNA在大鼠十二指腸、回腸和結(jié)腸均有表達(dá)，且回腸量最多，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示GPR55主要存在于大鼠十二指腸、回腸和結(jié)腸肌層神經(jīng)叢［19］，本實(shí)驗(yàn)中也觀察到，小鼠回腸也有GPR55表達(dá)，有趣的是，在小鼠炎癥腸道，GPR55表達(dá)在蛋白水平明顯上調(diào)，提示炎癥時(shí)GPR55受體激活，可能參與病理狀態(tài)下胃腸功能(包括運(yùn)動(dòng)功能)的調(diào)節(jié)，這一發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典CB受體相似［20］。CBD為植物大麻中研究得最透徹的非精神性生物活性成分，是GPR55受體拮抗劑，近年發(fā)現(xiàn)也有反向激動(dòng)的作用;而O-1602是人工合成的CBD類(lèi)似物，作為潛在的GPR55激動(dòng)劑，在某些病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用O-1602和CBD不影響GPR55表達(dá)，在LPS導(dǎo)致的炎癥腸道，CBD明顯降低GPR55蛋白表達(dá)，同時(shí)有效降低小鼠血清IL-6水平，這與我們課題組的另一項(xiàng)胰腺炎研究中得到的結(jié)果相吻合［21］，提示CBD在體內(nèi)通過(guò)抗炎機(jī)制改善小腸運(yùn)動(dòng)。

Figure 7.Effects of O-1602，CBD and LPS on the activity of Ca2+-ATPase in smooth muscle tissues.±sE.n=6.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖7 O－1602、CBD和LPS對(duì)平滑肌組織Ca2+－ATPase活性的影響

胃腸道平滑肌是胃腸道動(dòng)力的核心單位，各種因素最終都要通過(guò)胃腸道平滑肌來(lái)發(fā)揮調(diào)控胃腸道動(dòng)力的作用，體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，各濃度的CBD對(duì)10Hz電刺激誘導(dǎo)的收縮無(wú)明顯影響，在LPS導(dǎo)致的10Hz電刺激收縮紊亂模型，CBD預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)LPS的效應(yīng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的CBD抗痙攣?zhàn)饔靡恢拢?2］。而在自發(fā)性收縮的研究中，CBD對(duì)正常肌條自發(fā)性收縮無(wú)明顯影響，在劑量為10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L時(shí)阻斷LPS對(duì)回腸自發(fā)性收縮的效應(yīng)，即逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)回腸收縮的抑制，提示CBD對(duì)病理腸道發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，主要取決于病理腸道的狀態(tài)。O-1602(10-7mol/L)抑制小鼠回腸平滑肌電刺激引起的收縮幅度，并在一定程度拮抗LPS引起的電刺激收縮的加強(qiáng)，但不影響病理狀態(tài)下回腸自發(fā)性收縮。這表明，在正常大、小鼠，CBD不改變回腸收縮活性，也不改變膽堿能運(yùn)動(dòng)功能;病理狀態(tài)下，CBD不僅改變平滑肌收縮活性，而且改變膽堿能運(yùn)動(dòng)功能。高濃度的O-1602可以改變正常小腸平滑肌的收縮活性，又可通過(guò)突觸前GPR55抑制膽堿能運(yùn)動(dòng)功能;在病理狀態(tài)下，O-1602可通過(guò)抑制膽堿能運(yùn)動(dòng)功能，減輕LPS導(dǎo)致的小腸運(yùn)動(dòng)紊亂。

胃腸道平滑肌細(xì)胞膜電位是影響平滑肌反應(yīng)性，進(jìn)而改變其舒縮活動(dòng)的主要因素，前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)針對(duì)經(jīng)典CB1和CB2受體的相關(guān)CB制劑對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)功能的影響與平滑肌細(xì)胞膜電位之間有一定聯(lián)系。為了進(jìn)一步明確O-1602和CBD對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制，我們觀察了二者對(duì)小腸平滑肌細(xì)胞膜電位和慢波的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，O-1602和CBD這兩種新制劑在生理及病理生理狀態(tài)下對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)的電變化均無(wú)明顯影響，說(shuō)明它們與經(jīng)典CB受體的配體作用機(jī)制有所不同，其胃腸動(dòng)力效應(yīng)可能不包括平滑肌細(xì)胞膜電位的改變，這一結(jié)論需要進(jìn)一步測(cè)定電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent calcium channel，VDCC)等離子通道電流加以確定。

對(duì)平滑肌收縮來(lái)說(shuō)，需要有起細(xì)胞的興奮、傳導(dǎo)、電-機(jī)械偶聯(lián)等多個(gè)環(huán)節(jié)。Ca2+濃度是平滑肌收縮反應(yīng)中的關(guān)鍵因素。Ca2+-ATPase存在于細(xì)胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)上，是肌漿網(wǎng)中含量最豐富的蛋白，對(duì)建立跨膜的離子梯度，維持細(xì)胞膜電位、正常細(xì)胞生理活動(dòng)和代謝，具有重要作用，是調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的最重要物質(zhì)，平滑肌細(xì)胞舒張期胞漿內(nèi)Ca2+濃度下降的70%～90%的鈣離子是通過(guò)它回?cái)z取的，因此，可以將腸道組織Ca2+-ATPase活力作為腸道能量代謝及功能損傷的重要指標(biāo)。為了明確O-1602和CBD的作用途徑，我們測(cè)定了平滑肌組織Ca2+-ATPase的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS和高濃度的O-1602均能明顯增強(qiáng)小鼠空腸平滑肌組織Ca2+-ATPase活性，從而增加Ca2+經(jīng)細(xì)胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)到減少胞內(nèi)Ca2+、抑制平滑肌收縮的效應(yīng);而CBD單獨(dú)應(yīng)用對(duì)平滑肌組織Ca2+動(dòng)員無(wú)明顯影響，但可以拮抗LPS導(dǎo)致的Ca2+-ATPase活性的增強(qiáng)。以上結(jié)果與最近的一項(xiàng)CBD在神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)的研究結(jié)果相似［23］。在本實(shí)驗(yàn)條件下，低劑量O-1602不動(dòng)員胞內(nèi)Ca2+，在高濃度時(shí)顯示抑制Ca2+的效應(yīng)，但對(duì)LPS導(dǎo)致的Ca2+-ATPase活性升高沒(méi)有影響，這與其對(duì)回腸肌條自發(fā)性收縮的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，O-1602和CBD對(duì)Ca2+-ATPase活性的調(diào)節(jié)可能是影響回腸平滑肌自發(fā)性收縮的機(jī)制之一。

總之，我們的結(jié)果表明，在體內(nèi)，CBD通過(guò)抗炎作用有效改善小腸運(yùn)動(dòng);在體外，O-1602和CBD選擇性拮抗LPS導(dǎo)致的小腸運(yùn)動(dòng)紊亂，其機(jī)制不是通過(guò)改變平滑肌細(xì)胞膜電位，而可能與其調(diào)節(jié)Ca2+-ATPase活性有關(guān)。

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