雷鳴 程慶書 趙亞超 劉濤 王雪嬌 鄧迎春 楊菁 張志培

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，是國內(nèi)首位惡性腫瘤死亡原因[1,2]。目前化療仍是肺癌綜合治療的主要手段之一，在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治療中至關(guān)重要，研究[3]表明多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致NSCLC化療失敗的主要原因。SLC22A18（Solute Carrier Family 22, member 18）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的父系印跡基因，與腎母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肝母細(xì)胞瘤等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4]。該基因編碼蛋白與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體相似，影響藥物敏感性、細(xì)胞代謝和生長[5]，研究[6]表明其在細(xì)菌中的表達(dá)與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，提示其在哺乳動物細(xì)胞中可能具有相似的作用，可能在肺癌MDR的產(chǎn)生中發(fā)揮一定作用。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法檢測SLC22A18在NSCLC組織中的表達(dá)并分析其與NSCLC生物學(xué)、臨床特征的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究SLC22A18與腫瘤耐藥的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集唐都醫(yī)院胸外科2005年10月-2006年6月手術(shù)切除的NSCLC新鮮標(biāo)本96例。男61例，女35例。年齡34歲-73歲，中位年齡49歲。其中腺癌46例，鱗癌50例。所有患者術(shù)前均未接受過放、化療，術(shù)后即刻切取標(biāo)本，常規(guī)中性福爾馬林固定石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4 μm），用于免疫組化染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。組織病理分型、分級由病理科醫(yī)師診斷，術(shù)后進(jìn)行臨床分型。

1.2 試劑 SLC22A18兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司，抗兔二抗及免疫組化試劑盒購自西安壯志生物技術(shù)公司。

1.3 方法 免疫組化染色采用兩步法（EnVinsionTM），步驟如下：切片脫蠟至水，尿素消化，3%過氧化氫封閉，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行微波修復(fù)，冷卻，兔血清封閉，加一抗（1:50）4oC過夜。從冰箱取出，37oC復(fù)溫，自來水沖洗抗體，加入抗兔二抗（EnVinsion），37oC恒溫反應(yīng)（中間各步均用PBS沖洗），DAB顯色，顯微鏡觀察終止顯色。蘇木精輕微復(fù)染，脫水透明封片，在光鏡下觀察。對照組設(shè)正常組織和空白（以PBS代替一抗）對照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) SLC22A18以細(xì)胞膜及胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每例均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×400），判斷結(jié)果按照二級計(jì)分法，陽性細(xì)胞數(shù)目＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度分類：淡黃色為1分，黃色及深黃色為2分，褐色及深褐色為3分。將細(xì)胞陽性率與染色強(qiáng)度兩者積分相乘：0分為陰性（-），1分-4分為弱陽性（+），5分-8分為中度陽性（++），9分-12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，非小細(xì)胞肺癌和正常組織、鱗癌和腺癌的比較分析采用兩組等級資料Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，鱗癌和腺癌臨床分型比較分析采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，SLC22A18陽性表達(dá)主要定位于胞膜上和胞質(zhì)中（圖1A，圖1B），SLC22A18在肺鱗癌空白對照及正常肺組織中陰性表達(dá)（圖1C，圖1D）。非小細(xì)胞肺癌和正常組織中的陽性表達(dá)率分別為72.9%、52.1%，差異明顯（P＜0.001）（表1）。

圖 1 SLC22A18在NSCLC及正常肺組織中的表達(dá)。A：SLC22A18在肺鱗癌中的表達(dá)（×200）；B：SLC22A18在肺腺癌中的表達(dá)（×200）；C：SLC22A18在肺鱗癌空白對照（×100）；D：SLC22A18在正常肺組織中的陰性表達(dá)（×100）。Fig 1 Expression of SLC22A18 in NSCLC and normal lung tissue. A: Expression of SLC22A18 in lung squamous cell carcinoma (×200); B: Expression of SLC22A18 in lung adenocarcinoma (×200); C: Blank control in lung squamous cell carcinoma (×100); D:Expression of SLC22A18 in normal lung tissue (×100).

鱗癌中SLC22A18的總體陽性表達(dá)率為68.0%，腺癌為78.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=838, P=0.015）（表1）；其中II級、III級鱗癌陽性率分別為54.2%、80.8%，差異明顯（P=0.041），中分化、低分化腺癌陽性率分別為69.6%、86.9%，差異明顯（P=0.007）（表2）；鱗癌、腺癌不同TNM分期之間SLC22A18的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.044、0.034）（表3）。

3 討論

肺癌目前采用手術(shù)、化療、放療等多學(xué)科綜合治療，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，因而化療在肺癌治療中占據(jù)重要的地位，但腫瘤的多藥耐藥常常導(dǎo)致NSCLC化療失敗，其中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增強(qiáng)是其重要原因之一。因此，腫瘤的耐藥基因及耐藥蛋白仍是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。

基因SLC22A18位于人染色體11p15.5，轉(zhuǎn)錄方向從端粒到中心粒，有11個(gè)外顯子，cDNA全長1.5 kb，蛋白分子量43 kDa。研究[7]表明，SLC22A18編碼的蛋白有10個(gè)跨膜域，與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic cation transporters, OCT）具有一定同源性。SLC22A18與多藥耐藥基因1（multidrug resistance 1,MDR1）及乳癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）[8,9]同屬于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族，故推測其可能在腫瘤細(xì)胞中具有外排化療藥物從而產(chǎn)生多藥耐藥的作用。已有研究[10]證明SLC22A18過表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞耐藥性有所增強(qiáng)，但關(guān)于非小細(xì)胞肺癌中SLC22A18對化療藥物敏感性影響的具體研究目前還鮮見報(bào)道。

SLC22A18基因在胎兒肝臟、腎臟以及多種成體心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸和小腸等組織中表達(dá)[5,11]。在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究較少，尤其是在NSCLC中的表達(dá)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SLC22A18在NSCLC中的表達(dá)（72.9%）高于相應(yīng)正常組織（52.1%），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示SLC22A18在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能起一定的作用，并且可能對肺癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性產(chǎn)生影響。肺鱗癌、腺癌中SLC22A18都有較高的表達(dá)率（68%,78.2%），尤其腺癌中表達(dá)更高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SLC22A18的表達(dá)可能是腺癌多藥耐藥發(fā)生率高于鱗癌的機(jī)制之一，原因可能是在腺癌中SLC22A18基因在轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)控、氨基酸組裝及調(diào)控水平的差異，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外我們發(fā)現(xiàn)鱗癌、腺癌不同病理分級、不同TNM分期與SLC22A18的表達(dá)具有相關(guān)性，癌組織分化越差、分期越晚，表達(dá)越高（P＜0.05），說明其表達(dá)高低與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，并且與臨床上NSCLC化療晚期患者較早期患者相對不敏感相吻合，提示SLC22A18可能在NSCLC的多藥耐藥中有一定作用，并且有可能作為判斷NSCLC惡性程度以及不良預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一。

表 1 正常組織、癌組織間及鱗癌、腺癌間SLC22A18表達(dá)差異Tab 1 Comparison of SLC22A18 protein between NSCLC and normal lung tissue

表 2 鱗癌、腺癌不同病理分級間SLC22A18表達(dá)差異Tab 2 Expression of SLC22A18 in squamous and adenocarcinoma cell carcinoma with different pathological grade

表 3 鱗癌、腺癌不同TNM分期間SLC22A18表達(dá)差異Tab 3 Expression of SLC22A18 in squamous and adenocarcinoma cell carcinoma with different TNM stage

本研究通過檢測SLC22A18在NSCLC中的表達(dá)為臨床普遍存在腺癌比鱗癌更耐藥并且耐藥程度往往與腫瘤惡性程度相關(guān)的現(xiàn)象提供了理論根據(jù)，為進(jìn)一步研究SLC22A18與NSCLC多藥耐藥的相關(guān)性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。我們有理由相信在NSCLC綜合治療尤其是化療個(gè)性化用藥時(shí)，SLC22A18可能成為一個(gè)重要的分子標(biāo)志物。