周暉 熊曾 劉進(jìn)康 陳勝喜 周漠玲 劉洋騰宇

影響可切除性原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者生存最重要的因素是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，目前有研究[1]表明腫瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density, LMVD）與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但對它與影像學(xué)的關(guān)系還了解不多，本研究用免疫組化的方法檢測34例NSCLC患者手術(shù)標(biāo)本內(nèi)微淋巴管特異性標(biāo)志物podoplanin的表達(dá)，分析其與NSCLC淋巴轉(zhuǎn)移及肺癌結(jié)節(jié)多層螺旋CT（multi-slice spiral computed tomography,MSCT）表現(xiàn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年12月-2009年3月我院經(jīng)MSCT掃描、肺癌切除術(shù)和病理證實(shí)的NSCLC病例34例，均為肺內(nèi)單發(fā)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)直徑2.0 cm-3.0 cm；患者術(shù)前未行化療或放療等抗腫瘤治療，在CT掃描后1周內(nèi)手術(shù)；其中男性25例，女性9例；年齡44歲-73歲，平均58.3歲；按第7版AJCC肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，p-TNM分期I期12例，II期9例，III期13例。組織學(xué)分類：鱗癌15例，腺癌（含肺泡細(xì)胞癌）15例，腺鱗癌4例。病理證實(shí)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。高分化9例，中分化12例，低分化13例。

1.2 CT掃描和征象分析 采用Philips公司Brilliance型16層螺旋CT機(jī)。掃描范圍自腎上腺水平至肺尖，平靜呼吸下屏氣時(shí)掃描。主要技術(shù)參數(shù)為：120 kVp，100 mAs-250 mAs，探測器組合16 mm×1.5 mm，螺距值0.6-0.9，重建層厚2 mm，重建間隔1 mm，重建矩陣512×512。原始圖像數(shù)據(jù)傳輸?shù)焦ぷ髡荆∕XV Philips）后，以結(jié)節(jié)為固定中心進(jìn)行多平面重建技術(shù)（multiplanar reconstruction, MPR）操作，利用多種窗技術(shù)顯示結(jié)節(jié)內(nèi)部及結(jié)節(jié)-肺界面情況。利用表面遮蓋法（shaded surface display, SSD）、最大密度投影法（maximum intensity projection, MIP）、容積再現(xiàn)技術(shù)（volume rendering technique, VRT）等三維成像技術(shù)進(jìn)一步觀察病灶形態(tài)與周圍結(jié)構(gòu)關(guān)系，多種后處理技術(shù)的結(jié)合利用更全面、立體、準(zhǔn)確的評價(jià)結(jié)節(jié)的CT表現(xiàn)特征[2]。由2位具有5年以上胸部CT閱片經(jīng)驗(yàn)的放射科診斷醫(yī)師以雙盲法按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)病灶的MSCT征象，存在分歧時(shí)通過協(xié)商達(dá)成一致。本研究納入的MSCT征象分析指標(biāo)參照國內(nèi)外文獻(xiàn)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)[3]，選取能有效反映結(jié)節(jié)的生物學(xué)特征并被廣泛認(rèn)同的以下指標(biāo)：①邊緣形態(tài)（毛刺、淺分葉、深分葉、棘狀突起）；②結(jié)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)（空泡征、實(shí)性結(jié)節(jié)、部分實(shí)性結(jié)節(jié)）；③結(jié)節(jié)鄰近結(jié)構(gòu)（胸膜凹陷征、血管聚集征、阻塞性表現(xiàn)、癌性淋巴管炎）。MSCT圖像上測量肺門及各組縱隔淋巴結(jié)的短徑，短徑若＞1 cm則判為淋巴結(jié)腫大。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷 將已取到的腫瘤組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，厚4 μm連續(xù)切片制備涂膠白片供HE染色和免疫組織化學(xué)染色備用。行常規(guī)HE染色，觀察惡性結(jié)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化并根據(jù)2004年WHO肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分類和分級。使用試劑為鼠抗人podoplanin單克隆抗體（克隆號：H2907，美國Santa Cruz公司）、兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抗體（克隆號：SP28，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原（proliferation cell nucler antigen, PCNA）抗體（克隆號：PC10，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照說明書操作，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化氫連接（SP）二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色顯示腫瘤微淋巴管。以鄰近的正常肺實(shí)質(zhì)內(nèi)的微淋巴管為陽性內(nèi)對照，并參照試劑訂購公司提供的陽性結(jié)果照片，PBS代替一抗為空白對照。腫瘤微淋巴管判斷標(biāo)準(zhǔn)及微淋巴管密度計(jì)數(shù)方法參照Weidner等[1,5,6]報(bào)道的方法并加以改進(jìn)，LMVD分中心區(qū)（結(jié)節(jié)最大層面的中心部分，測量點(diǎn)距腫瘤中心的距離占腫瘤半徑的50%），周圍區(qū)（中心區(qū)以外距結(jié)節(jié)邊緣2 mm-3 mm以內(nèi)的環(huán)狀區(qū)域），計(jì)數(shù)時(shí)先在低倍鏡（×100）下觀察全層腫瘤組織，確定區(qū)域內(nèi)微淋巴管密度最大的“熱點(diǎn)”，每區(qū)隨機(jī)抽取4個(gè)熱點(diǎn)，保證每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)域采樣均勻，每張切片共讀取8個(gè)熱點(diǎn)。于200 mm×0.74 mm視野下人工計(jì)數(shù)熱點(diǎn)的微淋巴管數(shù)目，取其平均值為各區(qū)域的LMVD。鄰近的正常肺實(shí)質(zhì)內(nèi)的微淋巴管不做計(jì)數(shù)對象，只作內(nèi)對照評價(jià)免疫組織化學(xué)染色。所有標(biāo)本的計(jì)數(shù)由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在不同的時(shí)間計(jì)數(shù)3次，選擇2次相同或相近數(shù)目的平均數(shù)。VEGF、PCNA表達(dá)結(jié)果判斷采用文獻(xiàn)通用的方法[7,8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以Mean±SD表示；若各組方差齊同，樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析；若方差不齊且無法校正，用t秩和檢驗(yàn)；多個(gè)指標(biāo)的相關(guān)分析采用Spearmen相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)節(jié)CT表現(xiàn)及三維重建技術(shù) 橫斷位原始圖像結(jié)合三維重建技術(shù)能全面、細(xì)致地表現(xiàn)出肺結(jié)節(jié)形態(tài)特征，更直觀地顯示病灶與周圍組織結(jié)構(gòu)的空間立體關(guān)系（圖1A-圖1D）；毛刺征19例；淺分葉9例，深分葉25例；棘狀突起10例；空泡征6例；實(shí)性結(jié)節(jié)25例，部分實(shí)性結(jié)節(jié)9例，未發(fā)現(xiàn)非實(shí)性結(jié)節(jié)；胸膜凹陷征28例；血管聚集征24例；阻塞改變（阻塞性肺炎或節(jié)段性不張）5例；癌性淋巴管炎16例；34例肺結(jié)節(jié)內(nèi)均未見空洞及脂肪。

2.2 肺癌微淋巴管密度與CT表現(xiàn) Podoplanin陽性表達(dá)的淋巴管多數(shù)位于NSCLC組織的邊緣區(qū)，少數(shù)位于鱗癌巢周緣、腺癌的癌間質(zhì)內(nèi)。癌組織中心區(qū)淋巴管數(shù)目較少，大部分?jǐn)U張不明顯，可閉塞成條索狀；癌周組織淋巴管密度增多，大部分不規(guī)則明顯擴(kuò)張且管壁結(jié)構(gòu)不完整，圍繞癌組織成環(huán)狀分布（圖1D-I）。周圍區(qū)LMVD（17.6±3.7）高于中心區(qū)LMVD（10.0±2.8）（P＜0.001）。存在病理性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組肺結(jié)節(jié)的周圍區(qū)（20.2±3.5）明顯大于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（15.5±2.0）（P=0.008），存在病理性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組肺結(jié)節(jié)的中心區(qū)LMVD（10.2±3.7）與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（9.8±1.8）無明顯差異（P=0.062）；有淋巴結(jié)腫大和無淋巴結(jié)腫大兩組之間各區(qū)域LMVD均無明顯差異（P均＞0.05）。Spearmen相關(guān)分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺門、縱隔淋巴結(jié)腫大無關(guān)（P＞0.05）；周圍區(qū)LMVD與VEGF表達(dá)強(qiáng)度、PCNA陽性率均正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.600、0.570（P均＜0.01）；中心區(qū)LMVD與VEGF表達(dá)強(qiáng)度和PCNA陽性率均不相關(guān)（P均＞0.05）。

肺癌結(jié)節(jié)MSCT表現(xiàn)與腫瘤組織LMVD關(guān)系見表1。有棘狀突起征組、有胸膜凹陷征組、有癌性淋巴管炎組的周圍區(qū)LMVD均高于無此征象組的周圍區(qū)LMVD，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)性結(jié)節(jié)組和部分實(shí)性結(jié)節(jié)組之間及有毛刺征組、有分葉征組、有空泡征組、有血管聚集征組、有阻塞病變組與無此表現(xiàn)組周圍區(qū)LMVD比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中心區(qū)LMVD在各表現(xiàn)不同組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

惡性腫瘤主要通過血道和淋巴道形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是影響療效和患者死亡的重要原因，但大部分惡性腫瘤最初發(fā)生的轉(zhuǎn)移并不是通過血管，而是淋巴道[9]。目前對于肺癌結(jié)節(jié)CT表現(xiàn)與腫瘤生物學(xué)特征相關(guān)的研究多集中于血管生成方面，本研究使用已被證實(shí)具有良好特異性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物podoplanin[1,10]來檢測腫瘤LMVD，探討肺癌結(jié)節(jié)MSCT表現(xiàn)與腫瘤淋巴管生成之間的關(guān)系。

表 1 肺癌結(jié)節(jié)MSCT表現(xiàn)與腫瘤組織podoplanin陽性LMVD關(guān)系Tab 1 The relationship between CT characteristics and podoplanin-LMVD

圖 1 57歲男性右上肺NSCLC患者。MSCT橫軸位（A）顯示毛刺征，MPR技術(shù)顯示分葉征和結(jié)節(jié)后下方阻塞病變（B）、胸膜凹陷征和棘狀突起（C），VRT技術(shù)顯示血管聚集征（D）。組織病理HE染色：低分化腺鱗癌（×200）；免疫組化PCNA、VEGF染色均呈強(qiáng)陽性表達(dá)（×200，F(xiàn)，G）；podoplanin染色見中心區(qū)微淋巴管稀少（×400，H），癌間質(zhì)內(nèi)少量podoplanin表達(dá)（×400，H），周圍區(qū)微淋巴管較多，管腔擴(kuò)大且不規(guī)則（×400，I）。Fig 1 NSCLC found in the right upper lobe of a 57-year-old male. Axial images of MSCT shows spicules (A), MPR shows lobulated sign and distal side obstructive change (B), pleural indentation, and spinous process (C), VRT shows vessel convergence (D). HE staining of histopathology: poorly differentiated adenosquamous carcinoma (×200); Strongly positive expressions of PCNA, VEGF (SP×400, F, G); Lymphatic microvessels in the central areas were rare (podoplanin, SP×400, H), podoplanin were also expressed in few tumor stromata (SP×400, H), lymphatic microvessels in the peripheral areas were more with irregular and enlarged lumina (podoplanin, SP×400, I).

腫瘤淋巴管生成是指在腫瘤原位形成新的毛細(xì)淋巴管，由于腫瘤新生淋巴管結(jié)構(gòu)特殊，使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入淋巴管道形成轉(zhuǎn)移[9,10]。我們的研究結(jié)果顯示NSCLC組織中的微淋巴管主要存在于周邊區(qū)域，中心區(qū)域淋巴管較少而且多呈閉塞狀態(tài)，而周圍區(qū)微淋巴管大部分不規(guī)則明顯擴(kuò)張且管壁結(jié)構(gòu)不完整；分區(qū)域計(jì)數(shù)LMVD后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系分析結(jié)果顯示與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的是周圍區(qū)LMVD，中心區(qū)LMVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Liang等[11]的研究也認(rèn)為淋巴道轉(zhuǎn)移主要是通過癌周區(qū)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的開放和癌細(xì)胞對淋巴管管壁的破壞而進(jìn)入淋巴管管腔的。相對于單純的橫斷位圖像，MSCT多種后處理技術(shù)的綜合運(yùn)用能更好的顯示肺癌病灶內(nèi)部結(jié)構(gòu)、邊緣形態(tài)及與周圍結(jié)構(gòu)的關(guān)系[2]，本研究顯示MSCT圖像提示周圍區(qū)LMVD較高的表現(xiàn)包括有棘狀突起、胸膜凹陷征、癌性淋巴管炎，而肺癌的MSCT征象均與中心區(qū)LMVD無關(guān)。以上結(jié)果提示與轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能性淋巴管主要分布在腫瘤組織周邊，而出現(xiàn)棘狀突起、胸膜凹陷征、癌性淋巴管炎的表現(xiàn)提示腫瘤淋巴管生成旺盛，具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)微血管構(gòu)筑表型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)調(diào)控腫瘤血管新生與腫瘤增殖[7,12]，本研究還發(fā)現(xiàn)周圍區(qū)LMVD既和VEGF表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)又和PCNA陽性率正相關(guān)。目前普遍認(rèn)為VEGF家族通過VEGF/VEGF-R2途徑誘導(dǎo)血管形成，而通過VEGF-C/VEGF-D/VEGF-R3途徑誘導(dǎo)淋巴管形成[13,14]。近年來有研究[15,16]表明VEGF除了明顯促進(jìn)血管新生之外還有較強(qiáng)的促淋巴管生成和促淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用，VEGF和VEGF-C均是強(qiáng)大的內(nèi)皮調(diào)控因子，可以誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)微血管和微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，兩者之間可能存在協(xié)同作用[13,14,17]。VEGF是微血管和淋巴管通透性增高的主要因素，VEGF表達(dá)越高，微血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞連接越松散[15]，因此越容易發(fā)生癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。PCNA的表達(dá)是評價(jià)細(xì)胞增殖能力的主要指標(biāo)，這些細(xì)胞同時(shí)包括腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，從而可以評價(jià)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管和淋巴管新生的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微血管構(gòu)筑表型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不僅調(diào)控血管新生與腫瘤增殖，同時(shí)也調(diào)控淋巴管生成。

我們的研究還分析了淋巴結(jié)腫大與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者無關(guān)，而且有淋巴結(jié)腫大和無淋巴結(jié)腫大兩組之間各區(qū)域LMVD均無明顯差異，合并肺炎或患有增殖性病變均可導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，而沒有腫大的淋巴結(jié)可能已有轉(zhuǎn)移。因此，術(shù)前僅靠淋巴結(jié)形態(tài)學(xué)的檢查來判斷是否存在轉(zhuǎn)移有一定的誤差，提示我們還需要結(jié)合肺癌淋巴管生成狀態(tài)來對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行綜合評價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)棘狀突起、胸膜凹陷、癌性淋巴管炎等MSCT表現(xiàn)與腫瘤淋巴管生成有一定的相關(guān)性，出現(xiàn)這些征象的肺癌可能生長活躍、惡性程度高、較容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，該結(jié)果可為無創(chuàng)性評估腫瘤淋巴管生成狀態(tài)提供有意義的參考。