毛張凡 徐小惠 黃 杰 耿 慶

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，湖北武漢 430060；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430030

槲皮素是黃酮類化合物的一種，有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗高血壓、抗缺血再灌注損傷、抗腫瘤等[1-2]。但天然的黃酮類化合物不易于提取、制備和保存，加之其生物利用度低，半衰期短，效價(jià)低，均妨礙了其研發(fā)和利用。這些特點(diǎn)是由于其含有多個(gè)羥基。而用多甲基替代多羥基結(jié)構(gòu)會(huì)使黃酮類化合物具有明顯的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和藥效動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢。但目前天然多甲氧基黃酮由于提取工困難，其使得量少、價(jià)格貴，研究僅限于細(xì)胞水平而難以進(jìn)行體內(nèi)藥理學(xué)研究。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）是對(duì)槲皮素進(jìn)行了甲基化改造而獲得。由于工藝的改進(jìn)，獲得了高純度、低價(jià)位的PMQ，得以體內(nèi)研究PMQ的藥理學(xué)特性。

筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)PMQ除有較強(qiáng)的抗氧化作用外，還有對(duì)抗心肌肥厚、纖維化及靜脈內(nèi)膜增生的作用[3-4]，但考慮到臨床上兩者多相伴隨，如接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）或支架植入術(shù)（PTCA）的冠心病患者多伴有慢性充血性心力衰竭和心肌重構(gòu)，這些患者術(shù)后仍將面臨心肌肥厚、纖維化、心力衰竭和靜脈橋管再狹窄的問題，故本研究嘗試探索PMQ對(duì)這類患者是否有益。本實(shí)驗(yàn)通過制作大鼠頸部靜脈移植模型并用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模擬接受搭橋術(shù)的冠心病患者的體內(nèi)情況，通過口服PMQ干預(yù)，研究其是否有治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只（體重250～300 g，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部），正常喂養(yǎng)。所有大鼠均建立頸部自體靜脈移植模型，并均于第15 天開始皮下注射AngⅡ [288 μg/（kg·d），分 5次頸項(xiàng)部皮下緩慢注射][5]，于 21 d 后取材。

1.2 模型建立

所有手術(shù)均由同一人操作完成，所用顯微鏡是Carl Zeiss單人雙目手術(shù)顯微鏡（德國蔡司光學(xué)儀器公司），所用顯微外科手術(shù)器械購自上海手術(shù)機(jī)械廠。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后，1%肝素1 mL/kg腹腔注射肝素化。頸部備皮，縱行切口，無損傷游離頸外靜脈，用9-0 無損傷Polypropylene縫線（上海醫(yī)用縫合針廠）行頸外靜脈與頸總動(dòng)脈的端端間斷吻合。如靜脈移植血管充盈、紅潤、隨動(dòng)脈一起搏動(dòng)良好，則說明血管通暢，將血管復(fù)位，消毒后關(guān)閉切口。

1.3 分組及取材

動(dòng)物被平均隨機(jī)分為三組：模型組、溶劑組、治療組。分別每晨給予生理鹽水（5mL/kg）、溶劑[二甲亞砜（DMSO）和5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 溶劑按1∶9 配制，5mL/kg]和25mg/kg PMQ灌胃（DMSO為溶劑配制5%PMQ母液，每次給藥前按PMQ母液和5%PVP溶液1∶9 比例制成0.5%的PMQ黃白色乳劑，按5mL/kg即25mg/kg灌胃）。于第22 天麻醉后于原頸部切口處剪開皮膚，游離移植靜脈及兩端足夠長的頸動(dòng)脈。迅速開胸，取出心臟稱重。將移植靜脈及左室中段于4%多聚甲醛中固定，其余心肌組織液氮凍存待測。石蠟包埋，連續(xù)切片（厚5μm），取3 張切片行HE染色。

1.4 心肌肥厚指標(biāo)測定

剪除心房和大動(dòng)脈，吸干，用分析天平稱量心臟（HW）及左心室（LW）重量，除以體質(zhì)量（BW），得心臟指數(shù)（HW/BW）及左心指數(shù)（LW/BW）。

1.5 心肌纖維化指標(biāo)測定

羥脯氨酸含量用氯胺T法檢測（南京建成公司）。膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）Ⅰ/Ⅲ用免疫組化染色后用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 5.0）測定。每張切片隨機(jī)選6個(gè)視野（不含血管周圍膠原），計(jì)算每個(gè)視野Ⅰ、Ⅲ型膠原陽性部分占視野面積百分比，取其均數(shù)即為CVF。

1.6 新生內(nèi)膜增生測定

每張切片隨機(jī)4個(gè)點(diǎn)，用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 5.0）測量內(nèi)膜（I）與中膜（M）的厚度、面積比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析及Tukey HSD，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較

LVW/BW和HW/BW是反應(yīng)心肌肥厚程度的指標(biāo)。結(jié)果顯示溶劑組和模型組LVW/BW和HW/BW差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而治療組的LVW/BW和HW/BW明顯低于以另外兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）。見表1。

2.2 各組羥脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ比較

羥脯氨酸的含量可反映心肌總體纖維化的程度，CVFⅠ/Ⅲ反應(yīng)心室順應(yīng)性。治療組的心肌羥脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ顯著低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），從而抑制心肌纖維化，而溶劑組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較結(jié)果（±s，mg/g）

表1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較結(jié)果（±s，mg/g）

注：與治療組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別 HW/BW LVW/BW模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）2.87±0.23##2.93±0.39##2.55±0.38 2.29±0.24#2.38±0.17#1.98±0.20

表2 各組羥脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

表2 各組羥脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

注：與模型組比較，##P<0.01

組別 羥脯氨酸含量（μg/g） CVFⅠ/Ⅲ模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）503.5±31.4 498.3±25.8 422.1±31.8##4.7±0.8 4.6±0.6 3.4±0.6##

2.3 各組I/M厚度比及面積比

HE染色可見，模型組的新生內(nèi)膜明顯增生，而治療組的I/M厚度比和面積比均明顯小于模型組和溶劑組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。見表3。

表3 各組I/M厚度比及面積比（±s）

表3 各組I/M厚度比及面積比（±s）

注：與治療組比較，##P<0.01

組別 I/M厚度比 I/M面積比模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）1.51±0.35##1.57±0.17##0.89±0.18 1.83±0.33##1.79±0.28##1.15±0.14

3 討論

冠心病患者往往同時(shí)患有多種疾病，需服用多種藥物。接受CABG或PTCA的患者，其遠(yuǎn)期效果取決于血管新生內(nèi)膜增生的程度。如大隱靜脈是搭橋手術(shù)最常用的靜脈橋管，由于移植靜脈新生內(nèi)膜的增生，其10年閉塞率超過50%。雖然隨著手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)，其通暢率較前好轉(zhuǎn)，但內(nèi)膜的增生并不能通過手術(shù)技巧的改進(jìn)而徹底改善。由于冠心病患者術(shù)前既已發(fā)生心肌肥厚、纖維化等重構(gòu)改變，術(shù)后雖然心肌供血得以改善，但亦面臨心肌重構(gòu)發(fā)展、慢性充血性心力衰竭加重的問題，仍需服用減輕心肌重構(gòu)的藥物。同時(shí)移植橋管內(nèi)膜的增生所致遠(yuǎn)期再狹窄必須予以預(yù)防和治療。很多患者同時(shí)還患有高血壓、糖尿病、高血脂和肥胖等相關(guān)疾病，如代謝綜合征。而這些疾病相互關(guān)聯(lián)，部分有著共同的機(jī)制。有學(xué)者試圖尋找某些藥物在使患者面臨多個(gè)問題時(shí)能同時(shí)獲益，槲皮素是其中之一。PMQ比槲皮素有更好的生物利用度、更容易經(jīng)胃腸吸收、血藥溶度更好，而且某些生物學(xué)特性更優(yōu)。之前由于PMQ獲得量少無法進(jìn)行大劑量研究，目前工藝的改進(jìn)突破了藥源瓶頸，可以更好地研究其藥理學(xué)特性。已有的研究表明PMQ的主要藥理作用有：抑制細(xì)胞增值；促NO釋放；抗氧化，包括直接的抗氧化活性和抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性。NADPH氧化酶是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要源頭，并能調(diào)節(jié)其他途徑ROS的產(chǎn)生。ROS在心肌重構(gòu)、移植靜脈再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展中均起重要作用，被認(rèn)為是其重要的共同機(jī)制之一[6]，因此PMQ可能同時(shí)治療心肌重構(gòu)和移植靜脈的再狹窄。

皮下注射AngⅡ可誘導(dǎo)大鼠心肌重構(gòu)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)行頸部靜脈移植模型的大鼠皮下注射AngⅡ誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模擬接受搭橋或支架植入手術(shù)冠心病患者的體內(nèi)情況。結(jié)果表明PMQ能顯著減少實(shí)驗(yàn)大鼠的心肌肥厚及纖維化的程度從而抑制心肌的重構(gòu)；同時(shí)PMQ能顯著抑制血管新生內(nèi)膜的形成。此結(jié)果提示PMQ能同時(shí)治療接受搭橋或支架植入手術(shù)的冠心病患者面臨的兩大主要問題。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式的改變，許多冠心病患者同時(shí)合并多種疾病，病情復(fù)雜，而且這些將會(huì)相互作用，影響CABG的手術(shù)效果。如糖尿病、肥胖、高血壓、心力衰竭會(huì)加速再狹窄的發(fā)生，而冠脈血管的再狹窄又會(huì)加重心力衰竭。因此應(yīng)當(dāng)有一種方法，在分別治療的同時(shí)進(jìn)行綜合治療這些相互關(guān)聯(lián)的疾病從而達(dá)到更好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PMQ有作為治療那些行CABG或PTCA患者藥物的潛力。雖然PMQ在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出來的效果并不是很理想，但即使是作為行CABG或PTCA患者的輔助治療性藥物，也值得進(jìn)一步研究。

[1] Ross JA，Kasum CM.Dietary flavonoids：bioavailability，metabolic effects，and safety[J].Annu Rev Nutr，2002，22：19-34.

[2] Geleijnse JM，Hollman P.Flavonoids and cardiovascular health：which compounds，what mechanisms?[J].Am J Clin Nutr，2008，88（1）：12-13.

[3] Mao Z，Liang Y，Du X，et al.3，3'，4'，5，7-Pentamethylquercetin reduces angiotensinⅡ-induced cardiac hypertrophy and apoptosis in rats[J].Can J Physiol Pharmacol，2009，87（9）：720-728.

[4] 毛張凡，徐小惠，孫宗全，等.五甲基槲皮素抗靜脈移植物狹窄[J].中華胸心血管外科雜志，2010，26（6）：405-408.

[5] 毛張凡，徐小惠，黃杰，等.大鼠頸部自體靜脈移植模型兩種吻合方法的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（12）：31-33，41，98.

[6] Quinn MT，Gauss KA.Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase： comparison with nonphagocyte oxidases[J].J Leukoc Biol，2004，76（4）：760-781.

[7] Matsuno K，Yamada H，Iwata K，et al.Nox1 is involved in angiotensin Ⅱ-mediated hypertension：a study in Nox1-deficient mice[J].Circulation，2005，112（17）：2677-2685.