董長穎 于加平

摘要：以體積分?jǐn)?shù)為８０％的乙醇為提取劑，采用索氏提取法從草蓯蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）中提取齊墩果酸、熊果酸和綠原酸，然后用熱水提取法從殘渣中提取多糖。運用高效液相色譜法對草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸含量進行檢測，再運用分光光度法對草蓯蓉多糖含量進行測定。結(jié)果表明，草蓯蓉中含有較豐富的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖，其含量分別為０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％、１１．８３５％；回收率分別為９６．９０％～９９．８０％、９７．２０％～１００．３０％、９７．５０％～１００．２０％、９４．３０％～９８．６０％；變異系數(shù)分別為１．１３％、１．２６％、１．１０％、１．７４％。

關(guān)鍵詞：草蓯蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）；高效液相色譜法；齊墩果酸；熊果酸；綠原酸；多糖

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）16－3579-05

The Extraction and Content Determination of Four Active Components in

Boschniakia rossica

ＤＯＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｙｉｎｇ，ＹＵ Ｊｉａ－ｐｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｌｉｎ １３２１０１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ８０％（ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ） eｔｈａｎｏｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ， ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ ｂｙ ｓｏｘｈｌｅｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｔｈｅｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｂｙ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔs ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ were ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂ． ｒｏｓｓｉｃａ ｗａｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ０．５８６％，０．５７５％，０．３２６％ ａｎｄ １１．８３５％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９６．９０％～９９．８０％， ９７．２０％～１００．３０％， ９７．５０％～１００．２０％ ａｎｄ ９４．３０％～９８．６０％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｗｈｉｌｅ ＲＳＤ ｗａｓ １．１３％， １．２６％， １．１０％ ａｎｄ １．７４％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ； ＨＰＬＣ； ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

草蓯蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）俗稱不老草，為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物［１］，全草可用藥［２，３］。主要分布在中國的北方地區(qū)，此外，在日本的富士山區(qū)、朝鮮的北部山區(qū)等地區(qū)也有分布［４］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，草蓯蓉具有補腎壯陽、潤腸止血、滋補強身、延年益壽的功效［５］；主要用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎、前列腺炎以及腎臟和膀胱出血等疾?。郏叮荨ｉL期以來，人們對其進行了大量的科學(xué)研究，取得了很多的研究成果。但主要是對草蓯蓉的揮發(fā)油和多糖方面的研究比較多，對藥用價值極高、生物活性很強的齊墩果酸、熊果酸及綠原酸的研究很少。試驗以草蓯蓉為原料，對其中的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸及多糖進行提取和含量測定，以便于科學(xué)地開發(fā)和充分地利用這一寶貴資源，更好地為社會服務(wù)，為人類造福。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料草蓯蓉購買于吉林省長春市參茸市場，其生長于吉林省延邊朝鮮族自治州，經(jīng)專家鑒定為草蓯蓉，經(jīng)陰干、低溫烘干處理為干品，放于干燥器內(nèi)備用。

１．１．２試劑甲醇、乙腈（色譜純）購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，乙酸、磷酸、無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸和苯酚購自沈陽市新化試劑廠，齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所，葡萄糖購自天津化學(xué)試劑有限公司。

１．１．３主要儀器島津ＬＣ－２０Ａ型高效液相色譜儀、Ｓｈｉｍａｄｚｕ島津氣相色譜儀工作站、島津色譜柱（４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ，５ μｍ，十八烷基硅烷鍵合硅膠）、島津色譜柱（４．６ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ，５ μｍ，十八烷基硅烷鍵合硅膠）購自日本島津株式會社，ＵＶ－１６００型記錄式紫外－可見分光光度計購自北京瑞利分析儀器有限公司，索氏提取器購自上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司，ＥＳＪ２０５－４型電子天平購自沈陽龍騰電子有限公司，１０１－３型電熱鼓風(fēng)箱購自中國上海第二五金廠，Ａｎｋｅ ＴＧＩ－１６Ｂ型離心機購自上海安亭儀器設(shè)備有限公司，ＲＥ－５２ＡＡ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠，ＳＨＢ－ＩＩＩＡ型循環(huán)水真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司，ＸＡ－１型固體樣品粉碎機購自江蘇省金壇市恒豐儀器廠。

１．２方法

１．２．１溶液的配制

１）齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液和綠原酸對照品溶液的配制。分別精密稱取齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對照品２２．４０、２０．３０和５．８０ ｍｇ，分別置于２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇后用超聲波輔助溶解并定容，搖勻。取齊墩果酸、熊果酸對照品溶液各５ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，搖勻。將齊墩果酸和熊果酸混合對照品溶液及綠原酸對照品溶液用０．２５ μｍ濾膜過濾，濾液即對照品溶液。齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的濃度分別為０．４４８、０．４０６和０．２３２ ｍｇ／ｍＬ。

２）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取于１０５ ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品２５．００ ｍｇ，置于２５０ ｍＬ容量瓶中，用去離子水溶解、定容，搖勻，即得濃度為０．１０ ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

３）苯酚溶液的配制。?。福?ｇ苯酚，加０．１ ｇ鋁片和０．０５ ｇ ＮａＨＣＯ３，蒸餾，收集１８２ ℃餾分［７］。稱?。?ｇ，加水溶解，定容于１００ ｍＬ棕色容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

１．２．２草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸與多糖的提取

１）草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的提取。將干燥的草蓯蓉用粉碎機粉碎，稱?。玻埃埃埃?ｇ，用濾紙包好，置于索氏提取器中，取體積分?jǐn)?shù)為８０％的乙醇溶液１００ ｍＬ，先往索氏提取器中加體積分?jǐn)?shù)為８０％的乙醇溶液至與虹吸管相平，剩余液體加入圓底燒瓶中，浸泡樣品２ ｈ，然后在水浴鍋上加熱回流至無色，控制溫度在７５ ℃左右。把回流液倒入１００ ｍＬ容量瓶中，超聲波輔助溶解，過濾，定容，所得待測液放于冰箱中待用。

２）草蓯蓉中多糖的提取與純化。準(zhǔn)確稱取提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘渣１５．０００ ｇ，置于５００ ｍＬ燒杯中，再加去離子水３００ ｍＬ，在水浴鍋上加熱提?。?ｈ，間歇攪拌，過濾，減壓濃縮至１００ ｍＬ，用Ｓｅｖａｇｅ法［８］除蛋白質(zhì)，過濾，將濾液調(diào)至ｐＨ ８．０，然后用Ｈ２Ｏ２法［９］脫色，脫色后用流動水透析４８ ｈ，透析液加無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為８０％，于冰箱中靜置過夜醇沉，再離心分離，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗２次，最后真空干燥至恒重，即得精制的草蓯蓉多糖。

１．２．３檢測波長和流動相的選擇

１）檢測齊墩果酸和熊果酸的色譜條件。采用４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ的島津色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑，填料粒度為５ μｍ，流速為０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫為２０ ℃。按齊墩果酸計，理論板數(shù)不低于５ ０００，按熊果酸計，不低于４ ０００。選擇最佳的檢測波長和流動相。

２）檢測綠原酸的色譜條件。采用４．６ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ的島津色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑，填料粒度為５ μｍ，流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫為２５ ℃。按綠原酸峰計算，理論板數(shù)應(yīng)不低于４ ０００。選擇最佳的檢測波長和流動相。

１．２．４標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

１）齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取齊墩果酸和熊果酸混合對照品溶液５．０、７．０、９．０、１０．０、１３．０、１５．０ μＬ，進樣并記錄色譜圖，以齊墩果酸和熊果酸混合對照品溶液的進樣量為縱坐標(biāo)，峰面積積分值為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程：■齊墩果酸＝７．１２２×１０－７ｘ－０．０３１ ５，ｒ＝０．９９９ ９；■熊果酸＝８．５６０×１０－７ｘ－０．０４２ １，ｒ＝０．９９９ ６。在齊墩果酸進樣量為２．２４～６．７２ μｇ，熊果酸進樣量為２．０３～６．０９ μｇ，進樣量與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

２）綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取綠原酸對照品溶液１．０、３．０、５．０、７．０、１０．０、１５．０ μＬ，進樣并記錄色譜圖，以綠原酸對照品溶液的進樣量為縱坐標(biāo)，峰面積積分值為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程■＝５．６４６×１０－７ｘ－０．０９５ ７５，ｒ＝０．９９９ ６。在綠原酸進樣量為０．２３２～３．４８０ μｇ，進樣量與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

３）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０、１．４０ ｍＬ，依次加去離子水至終體積均為２ ｍＬ。另取去離子水２ ｍＬ作空白試驗，每支試管加１ ｍＬ ６０ ｇ／Ｌ苯酚溶液，搖勻。用移液管向每支試管中緩慢加入５ ｍＬ濃硫酸，搖勻，放置１５ ｍｉｎ后置于４０ ℃水浴加熱１０ ｍｉｎ，取出置于冷水中冷卻。在４９０ ｎｍ下測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：■＝１２．６４３ｘ－０．０３１，ｒ＝０．９９９ ７。

１．２．５樣品中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖含量的測定

１）草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸含量的測定。?。保?μＬ經(jīng)０．２５ μｍ濾膜過濾的草蓯蓉提取液，平行進樣５次，得色譜圖，根據(jù)回歸方程計算草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的含量。

２）多糖含量的測定。①換算因子的測定。準(zhǔn)確稱取５．００ ｍｇ草蓯蓉多糖，加去離子水定容于２５ ｍＬ容量瓶中。參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法處理后測定吸光度，按下式計算換算因子：ｆ＝ＣＳ／Ｃ（ＣＳ為多糖的濃度，Ｃ為多糖液中葡萄糖的濃度）。計算得草蓯蓉多糖的換算因子為４．８７。②樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘渣０．５００ ０ ｇ，置于２００ ｍＬ燒杯中，再加去離子水５０ ｍＬ，在水浴鍋上加熱提?。?ｈ，間歇攪拌，過濾，定容于２５０ ｍＬ容量瓶，?。?ｍＬ，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法處理后測定吸光度，根據(jù)回歸方程求草蓯蓉的葡萄糖含量，再根據(jù)換算因子求得多糖的含量。

１．２．６穩(wěn)定性試驗取齊墩果酸、熊果酸、綠原酸對照品溶液和多糖溶液，分別在０、１、２、４、８、１２、２４ ｈ后測定齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的峰面積積分值及多糖的吸光度，考察齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對照品溶液放置后峰面積積分值及多糖吸光度的變化情況。

１．２．７重現(xiàn)性試驗精密稱取草蓯蓉粉末及提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘渣各５份，分別按１．２．２的方法制備待測樣品溶液，按１．２．４的方法分析測定，根據(jù)１．２．５的方法分別計算齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量。

１．２．８回收率與精密度試驗為了考察方法的可靠性，分別進行了回收率和精密度的測定。準(zhǔn)確稱取草蓯蓉粉末０．１００ ｇ，準(zhǔn)確加入齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖各１．０００ ｍｇ，按１．２．２的方法提取制備待測液，按１．２．４的方法分析，計算得回收率和變異系數(shù)。

２結(jié)果與分析

２．１齊墩果酸、熊果酸和綠原酸檢測波長的選擇

將齊墩果酸、熊果酸和綠原酸用流動相分別配成待測溶液，用紫外-可見分光光度計于２００～４００ ｎｍ進行光譜掃描，結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸在２１０ ｎｍ處均有較強的吸光度，綠原酸在３２７ ｎｍ處有較強的吸光度。因此，檢測齊墩果酸和熊果酸時選擇２１０ ｎｍ作為檢測波長，檢測綠原酸時選擇３２７ ｎｍ作為檢測波長。

２．２高效液相色譜法流動相的選擇

２．２．１檢測齊墩果酸和熊果酸的流動相的選擇考慮到齊墩果酸和熊果酸均為三萜類化合物，結(jié)構(gòu)非常相似，采用高效液相色譜法也很難將這兩種化合物分離開。因此，在選擇流動相時進行了系統(tǒng)的研究，分別用體積比為８８∶１２的甲醇、水混合液，體積比為７０∶１０∶２０的乙腈、甲醇、水混合液，體積比為９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）等為流動相，分別進行分析。結(jié)果表明，以體積比為９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）作為流動相時，齊墩果酸和熊果酸的分離效果很好。而用其他流動相進行分離時分離效果很不好。因此，選擇體積比為９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）作為分析的流動相。

２．２．２檢測綠原酸的流動相的選擇考慮到綠原酸為苯丙素類化合物，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。因此，在選擇流動相時用體積比為８８∶１２的甲醇、水混合液，體積比為８８∶１２的乙腈、水混合液，體積比為１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液等進行試驗，結(jié)果表明，以體積比為１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液作為流動相時綠原酸分離效果很好，而其他流動相分離效果則不佳。因此，選擇體積比為１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液作為分析的流動相。

２．３草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的檢測結(jié)果

取按１．２．１法制得的對照品溶液５ μＬ和按１．２．２法制得的經(jīng)過０．２５ μｍ濾膜過濾的提取液５ μＬ，按１．２．３色譜條件分別進樣分析，平行進樣５次，得色譜圖，如圖１所示。由圖１可知，齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對照品的保留時間分別是１７．７３７、１８．８９２和１０．７５０ ｍｉｎ，草蓯蓉提取液的色譜圖中有３個色譜峰，它們的保留時間分別是１７．７０３、１８．８４９和１０．６８０ ｍｉｎ，根據(jù)在相同的色譜條件下保留時間相同的色譜峰是相同組分的原理可知，草蓯蓉中含有齊墩果酸、熊果酸和綠原酸。

２．４草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量

經(jīng)過測定得到草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量分別為０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％和１１．８３５％。如表１至表4所示。

２．５穩(wěn)定性試驗結(jié)果

齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的峰面積及多糖的吸光度的變異系數(shù)分別為０．４７％、０．２５％、０．５８％和０．１５％，表明它們在２４ ｈ內(nèi)穩(wěn)定。

２．６重現(xiàn)性試驗結(jié)果

齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的變異系數(shù)分別為１．６３％、１．７８％、１．５３％和２．７３％，說明重現(xiàn)性較好。

２．７回收率與精密度試驗結(jié)果

為了考察方法的可靠性，分別進行了回收率和精密度的測定，結(jié)果如表１至表４所示。由表１至表４可知，齊墩果酸加標(biāo)回收率為９６．９０％～９９．８０％，變異系數(shù)為１．１３％；熊果酸加標(biāo)回收率為９７．２０％～１００．３０％，變異系數(shù)為１．２６％；綠原酸加標(biāo)回收率為９７．５０％～１００．２０％，變異系數(shù)為１．１０％；多糖加標(biāo)回收率為９４．３０％～９８．６０％，變異系數(shù)為１．７４％。由此可見，該分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

３結(jié)論

由試驗結(jié)果可知，草蓯蓉中含有較豐富的藥物活性很強的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖，其含量分別是０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％和１１．８３５％。此數(shù)據(jù)可為草蓯蓉藥用價值的進一步科學(xué)開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

試驗方法操作簡單，檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，是一種可行性較高的檢測方法，可作為草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的檢測方法。

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