韓晉輝，翟培，*，孫勇民

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

復(fù)合生物保鮮劑在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用

韓晉輝1，翟培1，*，孫勇民2

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

具有抗菌作用的合成多肽與茶多酚制成復(fù)合生物保鮮劑，通過涂抹于冷鮮肉表面研究其保鮮作用。測定復(fù)合保鮮劑處理后冷卻肉的揮發(fā)性鹽基氮以及感官指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，復(fù)合生物保鮮劑可以有效延長冷卻肉在0℃～4℃條件下的貯藏時(shí)間，保鮮時(shí)間達(dá)到15 d以上。

合成肽；復(fù)合保鮮劑；冷卻肉

Abstract:Synthetic peptide with antimicrobial activity and tea polyphenol made from bio-preservative for the preservation of chilled pork.Detected TVB-N value,sensory quality of chilled pork.The results showed that compound bio-preservative can increase the freshness and shelf life of chilled pork,shelf life could extend to 15 d at 0℃-4℃.

Key words：synthetic peptide;preservative compound;chilled pork

冷卻肉在生產(chǎn)、銷售中要求始終處于0℃～4℃條件下，此時(shí)大多數(shù)微生物的生長繁殖被抑制，可以確保肉的安全衛(wèi)生，但并不能完全抑制所有微生物的生長繁殖，一些嗜冷菌，如單核細(xì)胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，在冷藏條件下仍然會(huì)大量生長和繁殖，最終導(dǎo)致冷卻肉發(fā)生腐敗變質(zhì)[1]。冷卻肉的表面褐變是冷卻肉在銷售過程中常出現(xiàn)的另一類問題，在冷卻肉的貨架期內(nèi)應(yīng)使腐敗變質(zhì)和表面褐變控制到最低程度，目前這兩方面的問題已經(jīng)成為限制冷卻肉大力推廣和普及的主要障礙[2]。冷卻肉的腐敗主要是由于微生物繁殖到一定程度后會(huì)分泌蛋白酶，使蛋白質(zhì)分解為多肽和氨基酸，有的氨基酸進(jìn)一步被分解為硫化氫、吲哚、甲基吲哚和甲胺等有惡臭的物質(zhì)，并且有毒性；褐變主要原因是脂肪被氧化，產(chǎn)生過氧化物，促進(jìn)肌紅蛋白變色，最終使生肉表面失去光澤，發(fā)黏，并產(chǎn)生腐敗臭氣，甚至長霉。

目前，食品產(chǎn)業(yè)應(yīng)用最廣泛的保鮮劑是化學(xué)保鮮劑。用化學(xué)保鮮劑處理能快速抑制冷卻肉表面的腐敗菌，顯著延長產(chǎn)品保質(zhì)期。但有些化學(xué)保鮮劑會(huì)影響冷卻肉的外觀，如肉色色澤變淡、汁液流失等問題。一些化學(xué)合成防腐劑過量使用對人體是有害的,許多國家的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都規(guī)定了最大允許使用量。隨著人們對食品安全的重視，越來越多的研究著力于相對化學(xué)保鮮劑更加安全環(huán)保的生物保鮮劑，生物保鮮劑極有可能代替化學(xué)保鮮劑。本實(shí)驗(yàn)所用合成多肽是根據(jù)天蠶素類抗菌肽的保守序列，通過生物信息學(xué)設(shè)計(jì)出的全新多肽。利用合成多肽與抗氧化物質(zhì)茶多酚組成復(fù)合保鮮劑，對冷卻肉的保鮮效果進(jìn)行研究，期望取得冷卻肉保鮮方法的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心保存。

1.1.2 主要試劑

多肽AMP-D：上海肽仕生物科技有限公司合成；營養(yǎng)肉湯、PBS緩沖液、無水乙醇、茶多酚（符合食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)）等。

1.1.3 主要儀器

DNM9602酶標(biāo)儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；SB-5200DTN超聲波清洗儀：上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司；GI6-2烘箱：常熟市雙杰測試儀器廠；LX-B75L滅菌鍋：廣州市予華儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海比朗儀器有限公司；96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定

將0.1mg/mL的合成多肽溶液倍比稀釋，當(dāng)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期(濃度為106cfu/mL~107cfu/mL）后，向96孔板中加入 150 μL菌懸液、30 μL不同濃度的合成多肽，然后放入37℃，100 r/min搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃100 r/min避光培養(yǎng)4 h后，觀察其顏色變化，以無水乙醇為對照組[3]。

1.2.2 熱處理對抑菌活性的影響

將合成多肽溶液置于不同溫度的水浴中（40、50、60、70、80℃）加熱15min。分別向96孔板中加入150μL菌懸液（菌濃度為106cfu/mL~107cfu/mL）以及加熱后合成多肽 30 μL（濃度為 0.1 mg/mL），放入 37℃，100 r/min搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃ 100 r/min避光培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定578 nm處吸光值。

1.2.3 揮發(fā)性鹽基氮的測定

將濃度為0.05 mg/mL的合成多肽溶液與0.1%茶多酚溶液按照1∶1比例混合，制成復(fù)合保鮮劑，將溶液涂抹于冷鮮肉表面，用保鮮膜包裹置于0℃～4℃下冷藏17 d，根據(jù)揮發(fā)性鹽基氮的測定原理，按照GB5009.44－2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中微量擴(kuò)散法對樣品和空白每日分別進(jìn)行測定。

1.2.4 復(fù)合保鮮劑處理后的感官檢測

復(fù)合保鮮劑涂抹于冷鮮肉表面，用保鮮膜包裹標(biāo)記，置于4℃冷藏，并每間隔一天進(jìn)行一次感官評定。感官評定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB 2707-94《豬肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行，由5名評價(jià)員進(jìn)行打分，結(jié)果取平均值，評定指標(biāo)見表1。

表1 感官指標(biāo)評價(jià)表Table 1 Sensory evaluation standards for chilled pork

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果

合成多肽是以天蠶素類抗菌肽為基礎(chǔ)，人工設(shè)計(jì)出的一種抗菌肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合成多肽對革蘭氏陽性菌有明顯的殺滅作用，多肽序列如下：KIGKKLEGVG KRVAVISDSHAKRLVGQAAALAK[4]。TTC是一種活菌染料，其氧化態(tài)是無色的，該染料進(jìn)入細(xì)胞后，TTC和活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的還原產(chǎn)物甲臜。抑菌活性測定和最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果見表2。

表2 合成肽對金黃色葡萄球菌MIC測定結(jié)果Table 2 The result of MIC polypeptide against Listeria monocytogenes

從表2可以看出，經(jīng)TTC染色后，培養(yǎng)基的顏色隨合成多肽濃度的增加而變淺，直至無色。表明合成多肽可抑制金黃色葡萄球菌的生長，且抑制作用隨多肽濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)合成多肽的濃度大于0.07 mg/mL（終濃度為：10.5 μg/mL）時(shí)，即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長，故其對金黃色葡萄球菌的MIC為 10.5 μg/mL。

2.2 熱處理對抑菌活性的影響

不同溫度處理后的多肽加入到菌液中，37℃培養(yǎng)24 h后，加入TTC溶液，在578 nm處測吸光值[5]。多肽熱處理后對抑菌活性的影響見圖1。

由圖1可以看出，在加熱溫度小于60℃時(shí)，溫度對多肽抑菌活性影響不大，隨著溫度增加，多肽活性逐漸減弱。由此實(shí)驗(yàn)可以看出合成多肽具有一定的耐熱性，具有良好的加工特性。這可能與多肽的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)系，合成多肽的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因此對加熱不是十分敏感。

2.3 揮發(fā)性鹽基氮的測定

按照GB 5009.44－2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》揮發(fā)性鹽基氮評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：一級鮮肉15 mg/100 g以下；二級鮮肉20 mg/100 g以下；變質(zhì)肉20 mg/100 g以上。本實(shí)驗(yàn)采用GB 5009.44－2003中揮發(fā)性鹽基氮的測定方法，測定結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，空白組在0℃～4℃儲(chǔ)藏過程中TVB-N值上升較快，11 d時(shí)TVB-N值已經(jīng)超過20 mg/100 g，即冷卻肉已經(jīng)腐??；經(jīng)過多肽溶液涂膜以后的冷卻肉貯藏時(shí)間明顯比空白組延長，第17天測定TVB-N值時(shí)仍然小于20 mg/100 g。由此可見，多肽溶液可以明顯阻止微生物的繁殖，從而有效延長了冷卻肉的貨架期。

2.4 復(fù)合保鮮劑對冷鮮肉感官指標(biāo)的影響

茶多酚溶液顏色較深，為了不影響冷卻肉的外觀，使用時(shí)溶液濃度較低，終濃度僅為0.05%，但在抗氧化方面起到了較好的效果。根據(jù)GB 2707-94《豬肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，5名評價(jià)員打分結(jié)果見表3。

表3 0℃～4℃條件下肉樣感官指標(biāo)綜合評分結(jié)果Table 3 Result of sensory quality score of chilled pork at 0℃-4℃

由表3可以看出，未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的冷卻肉在第9天時(shí)綜合評分為3分，感官指標(biāo)顯著低于處理后冷卻肉的感官評價(jià)值。經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的冷卻肉在第15天時(shí)感官評價(jià)值仍然達(dá)到鮮肉的評分范圍，可見復(fù)合保鮮劑可以有效延長冷卻肉的保藏期限。

3 結(jié)論

合成多肽對革蘭氏陽性菌有較好的抑制和殺滅作用，包括對嗜冷菌單核細(xì)胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）等多種微生物，因此合成多肽與茶多酚組成的復(fù)合保鮮劑可以起到顯著的保鮮作用，在0℃～4℃條件下，冷卻肉的保鮮時(shí)限可以達(dá)到15 d以上。由于合成多肽對革蘭氏陰性菌和真菌沒有抑制作用，對冷卻肉保鮮時(shí)限的進(jìn)一步延長有望通過合成多肽與其它抑制陰性菌的保鮮物質(zhì)共同作用實(shí)現(xiàn)。

[1]盧士玲,李開雄,徐幸蓮.不同生物保鮮劑對冷鮮肉抑菌效果的研究進(jìn)展[J].肉類研究,2008(2):38-41

[2]何曉燕,蔣其斌,夏天蘭,等.不同濃度茶多酚對冷卻肉的影響分析[J].食品工業(yè)科技,2010,31(6):81-83

[3]王倩,謝明杰.木犀草素對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其機(jī)制[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(9):1180-1184

[4]韓晉輝,翟培.天蠶素類抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及活性預(yù)測[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2011(2):32-35

[5]吳窈畫,談書華,范超超,等.MTT法檢測細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的主要影響因素分析[J].微生物學(xué)雜志,2011,21(3):67-71

Application of Composite Biological Preservation of Chilled Pork

HAN Jin-hui1,ZHAI Pei1,*，SUN Yong-min2
（1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,Guangdong,China;2.Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350,China）

2011-11-27

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院院級資助課題（2009YZ003）

韓晉輝（1979—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：營養(yǎng)與生物技術(shù)。

*通信作者：翟培（1980—），女，講師。