孫素華，孫金旭，朱會(huì)霞，鞏建英，劉艷立

（1.衡水學(xué)院，河北衡水053000；2.衡水中學(xué)，河北衡水053000）

響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝真菌發(fā)酵培養(yǎng)條件研究

孫素華1，孫金旭1，朱會(huì)霞1，鞏建英2，劉艷立1

（1.衡水學(xué)院，河北衡水053000；2.衡水中學(xué)，河北衡水053000）

借助于SAS8.0軟件，對(duì)樟芝真菌進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究。首先利用Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響樟芝真菌發(fā)酵的3個(gè)主要因素，即接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖添加量。在此基礎(chǔ)上用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，再利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，接種量與樟芝菌體產(chǎn)量存在極顯著的相關(guān)性，通過(guò)求解回歸方程得到優(yōu)化主要發(fā)酵條件，接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。經(jīng)培養(yǎng)驗(yàn)證，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)平均值接近，此優(yōu)化條件下樟芝菌體產(chǎn)量可達(dá)到7.06 g/L。

樟芝真菌；發(fā)酵；生物量；響應(yīng)面

Abstract:With SAS8.0 software,the use of Plackett-Burman experimental design method and response surface method analysis of a fermentation of antrodia camphorata.Optimization of process conditions.First of all,the use of Plackett Burman screening experimental design affect antrodia camphorata production three main factors,namely,inoculum size,incubation temperature and glucose addition.On this basis the most steep climbing path in response to approaching the largest region,re-use Box-Behnken experimental design and response surface method for regression analysis.The results showed that inoculum antrodia camphorata production and the existence of significant relevance,by solving the regression equation had been optimized main fermentation conditions.They were inoculum 15%,culture temperature 26.1℃,the volume of 3.9%glucose added.By cultivating authentication and verification test predictive value close to the average,the optimum conditions can be achieved antrodia camphorata yield 7.06 g/L.

Key words：antrodia camphorata；fermenting；biomass；RSM

樟芝的化學(xué)成分非常復(fù)雜，現(xiàn)代分離技術(shù)證實(shí)，樟芝含有防癌，抗癌，提高免疫力的生理活性物質(zhì)的主要成分為多糖體和三萜類化合物[1]。樟芝多糖提中主要含有β-D-葡聚糖，它能夠通過(guò)刺激巨嗜細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等增強(qiáng)人體免疫功能，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。由于樟芝是臺(tái)灣特有的種，惟一的寄主是牛樟樹(shù)[2]，隨著科技的發(fā)展，應(yīng)用的范圍不斷擴(kuò)大，需求量急劇上升。目前人工的子實(shí)體栽培比較困難，采用生物技術(shù)方法利用液體發(fā)酵培養(yǎng)樟芝菌絲體，并利用發(fā)酵液提取樟芝多糖是目前最經(jīng)濟(jì)，最符合環(huán)保的方法[3]。本文根據(jù)樟芝真菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)，利用SAS8.0數(shù)據(jù)處理軟件，以菌體為目的產(chǎn)物，對(duì)樟芝真菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

樟芝真菌：衡水學(xué)院生命科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO43.0，VB10.01，瓊脂 20.0，20%的土豆汁配制。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30.0，黃豆粉10.0，酵母膏 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0，VB10.01，pH 8.0，蒸餾水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為葡萄糖3.8%，氮源為蛋白胨0.4%，pH8.0，酵母膏

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子液的培養(yǎng)

從25℃下培養(yǎng)8 d的斜面上用接種鏟切1 cm2帶培養(yǎng)基的菌體轉(zhuǎn)入裝有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，25℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子以一定的接種量，接入裝有一定量培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在25℃培養(yǎng)溫度下、振蕩培養(yǎng)8d。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 生物量菌體干重的測(cè)定

取一定量的發(fā)酵液，用已烘干并稱重的濾紙過(guò)濾,用水沖洗至洗液不再帶有發(fā)酵液顏色為止。在80℃恒溫的烘箱中烘至恒重,在干燥器中冷卻至常溫,稱重。

3500 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用蒸餾水洗滌至無(wú)發(fā)酵液顏色，60℃烘干至恒重。稱重。

1.4.2 樟芝多糖的定量檢測(cè)

本研究采用苯酚—硫酸法。

1.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選樟芝發(fā)酵條件的重要因素

Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)法是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它試圖用最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究[4]，根據(jù)樟芝所需營(yíng)養(yǎng)要素和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和筆者的前期實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、搖瓶轉(zhuǎn)速（X7）、搖瓶裝液量（X8）8個(gè)因素進(jìn)行考察，分別對(duì)應(yīng)于表中的8列，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，響應(yīng)值為樟芝菌體產(chǎn)量（Y）。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。

1.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表

Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表，如表1所示。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 The level of Plackett-Burman design factors

1.5.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化樟芝發(fā)酵條件

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)樟芝發(fā)酵條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Levels of the variables in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選樟芝發(fā)酵條件的重要因素

根據(jù)樟芝生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要素和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和筆者的前期實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、搖瓶轉(zhuǎn)速（X7）、搖瓶裝液量（X8）8個(gè)因素進(jìn)行考察，分別對(duì)應(yīng)于表中的8列，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，響應(yīng)值為樟芝菌體產(chǎn)量。運(yùn)用Statistical Analysis System（SAS）8.0軟件分別計(jì)算各因素的菌體產(chǎn)量，并對(duì)各因素菌體產(chǎn)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，選擇置信度較高的因素作為顯著因素作進(jìn)一步考察。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experimental design matrix and theexperimental results

由表3、4及表3中因素的P值可以看出接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量這3個(gè)因素在α=0.05水平上對(duì)樟芝的菌體產(chǎn)量具有顯著影響，其P值分別為0.04305、0.04997和0.03768，其他因素在α=0.05的水平上對(duì)其表達(dá)量的影響不顯著。所以將接種量、培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量這3個(gè)因素進(jìn)一步采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域[6]。由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要因素的最陡爬坡路徑，其中接種量有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；培養(yǎng)溫度和葡萄糖用量有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表4 各因素的主效應(yīng)Table 4 Levels of the variables and effect in Plackett-Burmandesign

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Points on the first path of the steepest ascent study

由表5可見(jiàn)，最優(yōu)發(fā)酵條件可能在試驗(yàn)3與試驗(yàn)4之間，故以試驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化樟芝發(fā)酵條件

依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素與水平，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)樟芝發(fā)酵條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)。運(yùn)用SAS軟件的RSREG(Response surface regression)程序?qū)?5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，以樟芝菌體產(chǎn)量為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達(dá)式。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and the experimental results

該實(shí)驗(yàn)回歸方程為：

采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值及方差分析Table 7 Results of the Box-Behnken design regression analysis

該方程回歸顯著，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方即R2=99.27%，說(shuō)明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表6中的P值可知道，方程中X3對(duì)Y值的影響達(dá)顯著水平，而方程中 X1、X1X1、X2X2和 X3X3對(duì) Y 值的影響達(dá)極顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的關(guān)系，這和模型回歸中的線性和平方項(xiàng)影響顯著相對(duì)應(yīng)。交互項(xiàng)系數(shù)均不顯著，所以交互作用的影響相對(duì)較小。失擬項(xiàng)的P=2.116，沒(méi)有顯著性影響，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

通過(guò)軟件分析，得出當(dāng)樟芝菌體量最大時(shí)，X1=-0.0267；X2=0.0626；X3=-0.0732 ，計(jì)算得到樟芝液體發(fā)酵工藝最佳條件為：接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。此條件下，樟芝菌體產(chǎn)量最大值為7.03 g/L。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)際測(cè)得的樟芝菌體產(chǎn)量為7.06 g/L，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1%，因此，基于響應(yīng)曲面法所得的樟芝發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明響應(yīng)面方法是優(yōu)化發(fā)酵條件非常有效的工具，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)能對(duì)影響樟芝發(fā)酵的各因素進(jìn)行評(píng)價(jià)并能有效地找出主要因，最陡爬坡法能充分接近最大響應(yīng)面區(qū)域，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能建立主要因素影響樟芝菌體的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，找出最佳值。本研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化，得出樟芝真菌的最佳發(fā)酵條件為：接種量15%、培養(yǎng)溫度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%，優(yōu)化條件下經(jīng)三批搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)平均值接近，此培養(yǎng)條件下樟芝菌體產(chǎn)量可達(dá)到7.06 g/L。

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The Fermenting Condition of Culture Optimizing Study for Antrodia Camphorata Using of RSM

SUN Su-hua1,SUN Jin-xu1,ZHU Hui-xia1,GONG Jian-ying2,LIU Yan-li1
（1.Hengshui College,Hengshui 053000,Hebei,China;2.Hengshui High School,Hengshui 053000,Hebei,China）

2011-12-15

衡水學(xué)院資助課題（2008031）

孫素華（1970—），女（漢），副教授，碩士研究生，主要從事生物信息處理等方面的研究。