劉逸寒，薄嘉鑫，王亞品，張志萌，王建玲，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

枯草芽孢桿菌工程菌株產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉逸寒，薄嘉鑫，王亞品，張志萌，王建玲，路福平*

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

利用基因工程手段獲得的產(chǎn)長野芽孢桿菌普魯蘭酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌株WB600/pWB-pulB，通過單因素篩選及正交試驗進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，得到產(chǎn)酶最佳配方為玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。同時對重組菌株搖瓶條件下液體發(fā)酵的主要影響因素初始pH、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度等進(jìn)行探討，確定了產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)條件為，以3%接種量接種于優(yōu)化后培養(yǎng)基，初始pH7.0，裝液量30 mL/250 mL，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)36 h。在此優(yōu)化條件下，普魯蘭酶活力達(dá)到20.16 U/mL，是之前研究結(jié)果（10.94 U/mL）的1.84倍。

枯草芽孢桿菌工程菌株；長野芽孢桿菌；普魯蘭酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；酶活力

Abstract:The single factor comparative experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium and conditions in shaking flasks of Bacillus subtilis WB600/pWB-pulB for producing the pullulanase.The composition of the best medium was corn starch 3.0%,yeast extract 2.0%,CaCl20.03%,Na2HPO41.0%.In addition,the optimal fermentation conditions in shaking flasks were the combination of the inoculums size 3%,initial pH 7.0,medium volume 30 mL/250 mL,temperature 37℃,and shaking at 200 r/min for 36 h.Under these conditions,the activity of recombinant pullulanase reached 20.16 U/mL,which was 1.84 times of before result(10.94 U/mL).

Key words：engineeredBacillussubtilis;Bacillusnaganoensis;pullulanase;fermentationconditionsoptimization;enzyme activity

淀粉質(zhì)原料是迄今食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的原料，為直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成的混合物，其中含有75%~85%的支鏈淀粉，其不能被分解可影響到淀粉的利用率。普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中α-1，6糖苷鍵，從而切下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫支酶[1-2]。由于其能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料，可大幅提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率，因此在以淀粉為原料的深加工工業(yè)中有著重要的用途及良好的市場前景[3]。單獨使用普魯蘭酶可將支鏈淀粉全部轉(zhuǎn)變成高純度直鏈淀粉；同時，其可與α-淀粉酶、β-淀粉酶共同作用淀粉，制得超高麥芽糖漿；在糖化階段其與糖化酶協(xié)同作用，能有效地提高淀粉的水解速率，提高葡萄糖的產(chǎn)量和純度[4]。

現(xiàn)今，普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)菌株極少，僅有丹麥NOVO公司的B.acidopullulyticus和美國Genencor公司的B.deramificans等少數(shù)幾個菌株工業(yè)化生產(chǎn)的報道。國內(nèi)食品工業(yè)上所用的普魯蘭酶全部依賴于國外進(jìn)口，價格昂貴，造成生產(chǎn)成本較高。另外，目前國內(nèi)外大多數(shù)普魯蘭酶的研究主要集中在產(chǎn)普魯蘭酶野生菌株的選育[5-6]、性能鑒定[7]、誘變改造[8]及發(fā)酵工藝優(yōu)化[9-11]等手段提高普魯蘭酶的活力，但效果均不太理想。針對此種情況，本實驗室利用基因工程手段，構(gòu)建獲得一株可表達(dá)長野芽孢桿菌ATCC53909普魯蘭酶（最適作用溫度范圍40℃~60℃，最適作用pH范圍4.5~5.0）枯草芽孢桿菌工程菌株WB600/pWB-pulB，其活力達(dá)到10.94 U/mL，是原始出發(fā)菌株（2.7 U/mL）的4倍左右，實現(xiàn)了普魯蘭酶的高效表達(dá)。

本實驗基于前期研究，對工程菌株WB600/pWB-pulB發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其生產(chǎn)普魯蘭酶的能力，為淀粉深加工行業(yè)提供具有耐酸及耐熱性能的普魯蘭酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)長野芽孢桿菌普魯蘭酶枯草芽孢桿菌工程菌株WB600/pWB-pulB，由本實驗室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102控溫?fù)u床：上海志誠設(shè)備廠；TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速冷凍離心機(jī)GL20A：日本日立有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：江蘇國華儀器廠；HYG-FJ生物反應(yīng)搖瓶柜：上海新蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl1，瓊脂粉2，卡那霉素0.003，pH自然。

種子培養(yǎng)基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl1，卡那霉素0.003，pH自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl 1，pH 自然。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

分別對碳源、氮源、金屬離子、磷酸鹽的種類及濃度進(jìn)行單因素試驗，然后由單因素試驗擬定A碳源、B氮源、C金屬離子、D磷酸鹽4個因素各取3個水平，以L（934）型正交試驗表進(jìn)行試驗，以普魯蘭酶活力為指標(biāo)，確定重組菌的培養(yǎng)基最佳配比。

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在優(yōu)化得到的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基初始pH、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速及發(fā)酵溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最高活力的普魯蘭酶。

1.2.3 酶活的測定

酶活單位定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每分鐘分解普魯蘭糖產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量，即為1 U。測定方法采用DNS顯色法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

分別選取7種碳源進(jìn)行單因素碳源對產(chǎn)酶影響的試驗，結(jié)果如圖1所示。

玉米淀粉是產(chǎn)酶的最佳碳源，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為7.72 U/mL。當(dāng)玉米淀粉濃度為3.0%時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為9.18 U/mL。

2.1.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

分別選取7種氮源進(jìn)行單因素氮源對產(chǎn)酶影響的試驗，結(jié)果如圖2所示。

酵母膏是產(chǎn)酶的最佳氮源，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為9.84 U/mL。當(dāng)酵母膏濃度為2.0%時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為10.98 U/mL。

2.1.3 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響

選擇6種金屬離子，比較不同金屬離子對菌體產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，Zn2+、Fe2+對菌體產(chǎn)酶表現(xiàn)出抑制作用，K+、Na+對產(chǎn)酶沒有明顯促進(jìn)或抑制，Ca2+、Mg2+促進(jìn)產(chǎn)酶，其中Ca2+較Mg2+作用更為顯著。近一步研究不同濃度Ca2+對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)添加0.04%Ca2+時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為12.73 U/mL。因此，選擇0.04%為Ca2+最適濃度。

2.1.4 磷酸鹽濃度對產(chǎn)酶的影響

結(jié)果如圖4所示，當(dāng)磷酸鹽濃度為0.8%時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為13.87 U/mL。

2.1.5 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以玉米粉、蛋白胨、CaCl2、磷酸鹽為因素，每個因素取3個水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗設(shè)計，具體因素水平見表1，結(jié)果及極差分析見表2。

表1 培養(yǎng)基配方正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels array of orthogonal experiment of medium components %

由表2可知，極差分析結(jié)果表明4個因素的影響程度依次為：酵母膏＞玉米淀粉＞Na2HPO4＞CaCl2。在玉米淀粉、酵母膏、CaCl2和Na2HPO44種培養(yǎng)基組分的不同配比中，產(chǎn)普魯蘭酶活力最佳組合為：玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。對正交試驗中所得最佳組合進(jìn)行驗證，普魯蘭酶活力達(dá)到14.72 U/mL，大于正交試驗中出現(xiàn)的所有結(jié)果，驗證了結(jié)果的正確性，說明所選培養(yǎng)基配比為最優(yōu)組合。

表2 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果及其極差分析Table 2 Results and variance analysis of orthogonal experiment of medium components

2.2 工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響見圖5。

結(jié)果如圖5所示，初始pH為7（即培養(yǎng)基自然pH）時酶活力達(dá)到最高，為14.72 U/mL。初始pH過高或過低，酶活力均會下降。

2.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

接種量對產(chǎn)酶的影響見圖6。

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)以3%的接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，普魯蘭酶活力最高17.02 U/mL。因此，確定最佳接種量為3%。

2.2.3 裝液量對產(chǎn)酶的影響

裝液量對產(chǎn)酶的影響見圖7。

結(jié)果如圖7所示，裝液量30 mL時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為19.05 U/mL。因此，確定30 mL/250 mL為最適裝液量。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響見圖8。

結(jié)果如圖8所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為20.16 U/mL。因此，確定200 r/min為最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.5 溫度對產(chǎn)酶的影響

溫度對產(chǎn)酶的影響見圖9。

結(jié)果如圖9所示，當(dāng)溫度37℃時，菌體的生長最旺盛，普魯蘭酶活力達(dá)到最高，為20.16 U/mL。因此，確定37℃為最適發(fā)酵溫度。

3 結(jié)論

目前，國內(nèi)還未見長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)的報道。本實驗室利用枯草芽孢桿菌高拷貝表達(dá)載體pWB980及6個蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌宿主菌株WB600，構(gòu)建工程菌株WB600/pWB-pulB，實現(xiàn)了長野芽孢桿菌ATCC53909普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)。本實驗在此基礎(chǔ)上，對工程菌株WB600/pWB-pulB發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。分別研究了碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對普魯蘭酶活力的影響，通過正交試驗進(jìn)一步分析，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。同時，確定了搖瓶最佳發(fā)酵工藝：將重組菌的單菌落接種于種子培養(yǎng)基（50 mL/250 mL三角瓶）中，于37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)16 h后，以3%接種量接種于優(yōu)化后培養(yǎng)基（30mL/250mL三角瓶）中，初始pH7.0，37℃，200 r/min培養(yǎng)36 h后，普魯蘭酶活力達(dá)到20.16 U/mL，是之前研究結(jié)果(10.94 U/mL)的1.84倍。

[1]張樹政.酶制劑工業(yè)[M].北京:科學(xué)出版社,1998:77-83

[2]Ling H S,Ling T C,Mohamad R,et al.Characterization of pullulanase type II from Bacillus cereus H1.5[J].American journal of biochemistry and biotechnology,2009,5(4):170-179

[3]喬宇,丁宏標(biāo),王海燕,等.普魯蘭酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2011,1(3):189-194

[4]周念波,孫杰,王晶,等.普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工程,2008(2):18-20

[5]Bertoldo C,Armbrecht M,Becker F,et al.Cloning,sequencing,and characterization of a heat-and alkali-stable type I pullulanase from Anaerobranca gottschalkii[J].Applied and environment microbiology,2004,70(6):3407-3416

[6]王淑軍,呂明生,李華鐘,等.深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達(dá)[J].食品科學(xué),2010,33(19):309-312

[7]NairSU,SinghalRS,KamatMY.Inductionofpullulanaseproduction in Bacillus cereus FDTA-13[J].Bioresource technology,2007,98(1):856-859

[8]郭宏文,鄒東恢,杜國軍,等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的誘變育種[J].食品研究與開發(fā),2010,31(2):167-169

[9]朱夢,孫海彥,彭明.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與發(fā)酵條件的研究[J].食品研究與開發(fā),2011,32(7):136-140

[10]鞏培,戚薇,杜連祥,等.產(chǎn)氣氣桿菌產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].天津科技大學(xué)學(xué)報,2009,24(3):1-12,42

[11]Vester-Christensen M B,Hachem M A,Naested H,et al.Secretory expression of functional barley limit dextrinase by Pichia pastoris using high cell-density fermentation[J].Protein expression and purification,2010,69(1):112-119

[12]Miller GL.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Analytical chemistry,1959,31(3):426-428

Optimization of Fermentation Conditions for the Pullulanase Production by Engineered Bacillus subtilis

LIU Yi-han,BO Jia-xin,WANG Ya-pin,ZHANG Zhi-meng,WANG Jian-ling,LU Fu-ping*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,The College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

2012-06-10

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃（2011AA100905－4）；國家自然科學(xué)基金（31101219）

劉逸寒（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。

*通信作者：路福平，男，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。