張澤，高淑悅，程繼龍，顏士慧，李玉婷，李翀，張莉

(山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海，264209)

卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物的抗氧化活性*

張澤，高淑悅，程繼龍，顏士慧，李玉婷，李翀，張莉

(山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海，264209)

為了增強卵磷脂的抗氧化性能和水溶性，解決卵磷脂因存在穩(wěn)定性差，不易溶于水等缺點而無法得到廣泛應(yīng)用的難題，通過將β-環(huán)糊精對卵磷脂進行包絡(luò)，制備了卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物，并用紅外光譜和差熱分析對包絡(luò)產(chǎn)物進行了表征并檢測了包絡(luò)物的體內(nèi)抗氧化活性。研究結(jié)果表明，用卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物對小白鼠實施灌胃，能有效地降低小鼠肝臟中丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性。

卵磷脂，β-環(huán)糊精包絡(luò)物，抗氧化

環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)是由若干個吡喃型葡萄糖單元以α-1，4糖苷鍵相結(jié)合成互為椅式構(gòu)象的環(huán)狀低聚糖，含有6、7和8個吡喃葡萄糖單元的環(huán)糊精分別叫做α-，β-和γ-環(huán)糊精，它們內(nèi)腔呈錐形體，空腔內(nèi)側(cè)由氫原子及糖苷鍵合的氧原子構(gòu)成，是疏水的，外腔則由于羥基的聚集而呈親水性?！皟?nèi)疏水，外親水”的分子結(jié)構(gòu)，使其容易包結(jié)不同“客體”化合物形成特殊結(jié)構(gòu)的包結(jié)物(inclusion complexes)[1］。這種包合作用可以改變被包結(jié)客體分子的理化性質(zhì)，在許多領(lǐng)域得到應(yīng)用。卵磷脂是一種從植物或動物中通過物理加工方法提取出來的磷脂混合物，一般用卵磷脂來統(tǒng)稱這種混合物。卵磷脂是一種在動植物中分布很廣的磷脂，是天然的乳化劑和營養(yǎng)補品。20世紀(jì)70年代以來，美國就把卵磷脂用于保健食品，總銷量僅次于復(fù)合維生素和維生素E而名列第3[2］。據(jù)報道，卵磷脂在Cu、Fe、Mn等離子存在的情況下，具有很高的抗氧化活性[3］。此外，它還具有改善機體神經(jīng)功能障礙及紊亂、恢復(fù)腦功能、增強記憶力、防止心血管系統(tǒng)疾病及抗衰老等功效[4-5］。步文磊等[6］通過研究有關(guān)卵磷脂對小鼠體內(nèi)抗氧化體系的影響發(fā)現(xiàn)，卵磷脂能顯著降低小鼠血清中MDA含量。然而，磷脂存在著氧化穩(wěn)定性差，不易溶于水等缺點，影響了其廣泛應(yīng)用。為此謝文磊等[7］將β-環(huán)糊精與卵磷脂進行了包結(jié)，結(jié)果表明，約2分子的β-環(huán)糊精和1分子的卵磷脂依據(jù)范德華作用力和疏水作用力等發(fā)生包結(jié)作用，生成了穩(wěn)定的包結(jié)化合物。而且卵磷脂通過包結(jié)后其溶解度和抗氧化能力均有所增加。

本文利用差熱分析法和紅外光譜分析法驗證了β-環(huán)糊精與卵磷脂的包結(jié)作用，并對包結(jié)后產(chǎn)物的抗氧化活性進行了研究，旨在為開發(fā)一種新型的穩(wěn)定性、水溶性強的磷脂類抗氧化功能性食品和藥品提供的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

昆明種小鼠60只，18～22 g。雌雄各半，購于煙臺綠葉制藥有限公司。

1.1.2 試劑

卵磷脂:Sigma公司;β-環(huán)糊精:廣東省郁南縣環(huán)糊精廠，使用前二次重結(jié)晶，真空干燥;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總蛋白含量測試盒:南京建成生物工程研究所;其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3 設(shè)備

紫外可見分光光度計(U2008)，日本日立;集熱式恒溫磁力攪拌器，金壇市友聯(lián)儀器研究所;真空干燥機，東莞市創(chuàng)瑞工業(yè)試驗設(shè)備有限公司;JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-601電熱恒溫水浴鍋，金壇市精達儀器制造廠;差熱分析儀，Diamond TG/DTA 6300;美國Impact-400型傅立葉變換紅外光譜儀，美國尼高力。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物的制備

包絡(luò)物的制備工藝參考文獻[7］進行。稱取與一定質(zhì)量卵磷脂摩爾比為2∶l的β-環(huán)糊精溶入水中，避光通氮氣保護，在50～60℃加熱攪拌下。加入卵磷脂，反應(yīng)12 h，然后在室溫下靜置12 h，減壓抽濾，粗產(chǎn)品分別用熱水和甲醇充分洗滌，以除去殘留的β-環(huán)糊精和卵磷脂，真空干燥后得到的白色粉末即為卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物。

1.2.2 卵磷脂及其包絡(luò)物差熱分析鑒定

取卵磷脂和β-環(huán)糊精的物理混合物以及包絡(luò)物2種樣品在差熱分析儀進行差熱分析:稱取5.0 mg左右樣品，量程為±50 μV，升溫范圍為30～510℃，升溫速率為10℃/min，以α-Al2O3為參比，作DTA圖譜。

1.2.3 紅外光譜分析

將卵磷脂和β-環(huán)糊精的物理混合物及卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物用紅外光譜作定性分析。

1.2.4 卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物體內(nèi)抗氧化活性試驗

將60只昆明小白鼠隨機分為6組，正常對照組(生理鹽水組)、陽性對照組(VC組)、卵磷脂組及3個不同濃度的卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物實驗組。卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物實驗組每日每只灌胃卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物溶液，低濃度組:50 mg/kg體重小鼠，中濃度組:100 mg/kg體重小鼠，高濃度組:200 mg/kg體重小鼠;卵磷脂實驗組灌胃200 mg/kg體重小鼠;陽性對照組灌胃VC100 mg/kg體重小鼠;正常對照組灌胃同體積生理鹽水，連續(xù)20天。實驗期末，動物禁食12 h后處死小鼠，取出肝臟測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。

1.2.5 考馬斯亮蘭法測定蛋白含量

考馬斯亮蘭測定小鼠組織(肝臟)蛋白的方法依照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.2.6 測定樣品MDA含量、SOD和GSH-PX活性

分別依照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。其中超氧化物歧化酶(SOD)活力定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力是以催化GSH的反應(yīng)速度來表示，定義為每毫克蛋白，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進行處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，以P＜0.01為差異極顯著，以P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 包絡(luò)物的表征

2.1.1 差熱分析

從圖1和圖2中可以看出，卵磷脂和β-環(huán)糊精的包絡(luò)物以及兩者物理混合物的圖譜有明顯不同。二者的物理混合物在140℃和330℃出現(xiàn)放熱峰，在285℃和440℃出現(xiàn)吸熱峰，而在包絡(luò)物的圖譜上各個峰的位置和形狀都發(fā)生了變化，說明卵磷脂已經(jīng)被包絡(luò)到β-環(huán)糊精的空腔中。

圖1 卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物的熱差示分析圖譜

圖2 卵磷脂和β-環(huán)糊精物理混合物的熱差示分析圖譜

2.1.2 紅外光譜

將卵磷脂和β-環(huán)糊精的物理混合物及卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物做紅外光譜分析。結(jié)果如圖3所示，可以看出在1990～2400cm-1包絡(luò)物和物理混合物存在較大差異，這進一步證實了卵磷脂已經(jīng)被β-環(huán)糊精包絡(luò)。

2.2 卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物對小鼠肝臟中MDA含量和SOD和GSH-PX活性的影響

圖3 卵磷脂和β-環(huán)糊精的物理混合物及其包絡(luò)物的紅外光譜圖

MDA是氧自由基氧化細胞膜上磷脂形成的脂質(zhì)過氧化物的穩(wěn)定存在形式，可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因此，初始的一個活性氧能導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無害的，另一些則能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基化合物不但通過生物膜中不飽和脂肪酸(PUFA)的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷。因此測試MDA的量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶。它特異的催化還原性谷胱甘肽(GSH)對H2O2還原反應(yīng)，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用。因此，SOD和GSH-PX活性的高低也是反映機體清除自由基能力的重要指標(biāo)[8］。

肝臟是人體重要的解毒和代謝器官。當(dāng)自由基作用于肝細胞的胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，便開始引發(fā)膜磷脂的不飽和脂肪酸的過氧化，進而導(dǎo)致膜的通透性升高。過氧化作用的產(chǎn)物同時又可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細胞膜上的蛋白質(zhì)合成(如葡萄糖-6-磷酸酶和細胞色素P-450系統(tǒng))和某些酶的活性[9］，從而導(dǎo)致肝功能失調(diào)。因此研究抗氧化劑對肝臟的抗氧化能力意義十分重大。

各實驗組小鼠連續(xù)灌胃20 d后，小鼠肝臟組織中MDA含量、SOD和GSH-PX活性測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示:在對肝臟MDA含量影響方面，與空白對照組相比，VC組、卵磷脂組、卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物各劑量組均顯著降低了小鼠肝臟中MDA含量(P＜0.05);與VC組相比，卵磷脂組、卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物各劑量組不呈現(xiàn)差異顯著性(P＞0.05);與卵磷脂組給藥同等劑量的卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物高劑量組與卵磷脂組相比，MDA的含量相差不大，說明被β-環(huán)糊精包絡(luò)后的卵磷脂與未包絡(luò)的卵磷脂相比具有相似的降低小鼠肝臟中MDA含量的功效。在對肝臟SOD活性影響方面，與空白對照組相比，VC組、卵磷脂組顯著提高了小鼠肝臟中SOD活性(P＜0.05)，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物各劑量組均極顯著提高了小鼠肝臟中SOD活性(P＜0.01);與VC組相比，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物中劑量組顯著提高了小鼠肝臟中SOD活性(P＜0.05)，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物高劑量組極顯著提高了小鼠肝臟中SOD活性(P＜0.01)，與卵磷脂組給藥同等劑量的卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物高劑量組與卵磷脂組相比，SOD的活性更高，說明包絡(luò)后的卵磷脂具有更強的提高小鼠肝臟SOD活性的能力。在對肝臟GSH-PX活性影響方面，與空白對照組相比，卵磷脂組顯著提高了小鼠肝臟中GSH-PX活性(P＜0.05)，VC組和卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物各劑量組均極顯著提高了小鼠肝臟中GSH-PX活性(P＜0.01);與VC組相比，卵磷脂組呈現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物低劑量組呈現(xiàn)顯著性差異，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物中、高劑量組不呈現(xiàn)差異顯著性(P＞0.05)，與卵磷脂組給藥同等劑量的卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物高劑量組與卵磷脂組相比，具有更高的GSH-PX活性，說明包絡(luò)后的卵磷脂具有更強的提高小鼠肝臟GSH-PX活性的能力。

表1 灌胃20 d的小白鼠肝臟中GSH-PX活力、SOD活力和MDA含量變化(±SD)

表1 灌胃20 d的小白鼠肝臟中GSH-PX活力、SOD活力和MDA含量變化(±SD)

注:與對照組比較 a P ＜0.01，b P＜0.05;與 VC組比較 cP＜0.01，dP＜0.05。

組別 包絡(luò)物劑量/1036.41±8.3227.16±4.572.60±0.68 VC010450.31±45.01a42.49±1.72b0.56±0.09b卵磷脂 010191.98±59.92bc41.59±2.35b0.62±0.04b低劑量組 5010316.04±42.15ad60.98±8.57a0.66±0.24b中劑量組 10010444.98±65.28a64.74±9.26ad0.59±0.06b高劑量組 20010432.85±68.58a94.64±5.70ac0.65±0.13)］對照[mg·(kg·d)-1]動物數(shù)量/只 GSH-PX活力/V SOD活力/U[U·mg-1(prot)］MDA含量/[(nmol·mg-1(prot 0 b

試驗證明，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物可提高小鼠肝臟中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量。在對小鼠肝臟SOD和GSH-PX兩方面活性的影響方面，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物與卵磷脂相比顯示出了更好的活性。在對小鼠肝臟MDA含量影響方面，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物和卵磷脂的活性相似，二者都能明顯降低小鼠肝臟的MDA含量。

3 討論

氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)，既活性氧(ROS)，包括超氧陰離子、羥基自由基等。它們可與DNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸作用，造成DNA的斷裂和氧化性損傷，蛋白-蛋白交聯(lián)，蛋白-DNA交聯(lián)等，從而造成生物體氧化損傷，并進一步引起癌癥、衰老、心血管等慢性病[10］。對于抗氧化劑的研究，已經(jīng)成為最為活躍的研究課題之一[11-12］。

用β-環(huán)糊精對卵磷脂進行包絡(luò)制得包絡(luò)物，經(jīng)過體內(nèi)藥理試驗結(jié)果可知，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物可提高小鼠肝臟中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量。在提高小鼠SOD、GSH-PX活性方面，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物比卵磷脂的活性更加顯著;在降低小鼠肝臟MDA方面，卵磷脂-β-環(huán)糊精包絡(luò)物和卵磷脂的活性相似，二者都能明顯降低小鼠肝臟的MDA含量。

在所測定的3項指標(biāo)中包絡(luò)后的卵磷脂都比未包絡(luò)的卵磷脂要好。此外，磷脂的氧化主要發(fā)生在不飽和鍵上，而不飽和鍵主要位于β位脂肪酰基上，而且β-環(huán)糊精空腔外部為親水性，相對地增加了分子的親水性，因此卵磷脂通過包結(jié)抗氧化性能和親水性增加。在一定溫度下將卵磷脂和包結(jié)化合物加熱一定時間后分別測定其過氧化值，實驗結(jié)果說明包結(jié)化合物的過氧化值和過氧化值隨加熱時間增長的增加量均較卵磷脂為小，表明了通過與β-環(huán)糊精的包結(jié)作用，卵磷脂的抗氧化能力增加[7］。這樣就解決了卵磷脂存在的氧化穩(wěn)定性差，不易溶于水等問題，可以使卵磷脂得到更加廣泛的應(yīng)用。其次，本試驗的操作方法簡單易行，對實驗的儀器設(shè)備的要求不是很高，投入工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和可操作性都很強，具有巨大的開發(fā)價值和發(fā)展前景。

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ABSTRACTTo improve the antioxidation ability and water-solubility of phosphatidylcholine，phosphatidylcholine was inclusion with β-cyclodextrin.The antioxidative activity of phosphatidylcholine-β-cyclodextrin was studied and analyzed by infrared spectrum and athermalization.The results showed that after mice administered intragastrically with phosphatidylcholine-β-cyclodextrin，the level of MDA was reduced and the activities of SOD and GSH-PX were increased in liver.

Key wordsphosphatidylcholine，inclusion compound of β-cyclodextrin，antioxidation

Study on Antioxidation of Phosphatidylcholine with β-Cyclodextrin Compound Inclusion

Zhang Ze，Gao Shu-yue，Cheng Ji-long，Yan Shi-hui，Li Yu-ting，Li Chong，Zhang Li
(Marine College，Shandong University，Weihai 264209，China)

本科(張莉教授為通訊作者)。

*山東大學(xué)第六屆大學(xué)生科研立項重點項目(A11005)

2012-03-10，改回日期:2012-05-10